разкриване

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Значителна разлика във филогенетичните състави между трите места на свинете
  • Сравнение на функционалния капацитет на чревния микробиом в тънките черва и цекума
  • Сравнение на структурата на микробната общност сред свине с ясно съдържание на мазнини в различни чревни позиции
  • Сравнителен функционален капацитет на чревните микроби между прасета с високо и ниско тегло
  • дискусия
  • Материали и методи
  • Събиране на луминални проби от животни и карантии
  • Екстракция на луминална ДНК и анализ на последователността на 16S рРНК гени
  • Изграждане на ДНК файлове и библиотеки за метагеномно секвениране
  • Събиране на кратки четения
  • Генна прогноза и функционална класификация
  • Анализ на филогенетичен състав, базиран на данни за метагеномно секвениране
  • Сравнение на функционалния капацитет на чревните микроби
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

абстрактно

В това проучване ние се съсредоточихме върху използването на 16S rRNA генно секвениране и високопроизводителен подход за метагеномно секвениране, за да изясним структурата на микробната общност и потенциалния функционален капацитет на метагеномиката в йеюнума, илеума и апендикса при китайски прасета Laiwu, които показват силни мазнини способност за съхранение. Сравнихме микробния състав и потенциалния функционален капацитет на микробите между три чревни места и оценихме ефекта на чревната микробиота върху съхранението на свине.

резултатът

Значителна разлика във филогенетичните състави между трите места на свинете

За да охарактеризираме филогенетичния състав на бактериалните съобщества на различни места в червата, първо направихме анализ на последователността на гените 16S rRNA и сравнихме алфа-разнообразието на микробиотата между йеюнума, илеума и цекума. Цекумът е имал значително по-висок индекс на Шанън (отчитайки броя на видовете и баланса на видовете) от йеюнума и илеума (Р

Проведени са анализи на данни за 16S рРНК V4 регион. Имената на пробите са кодирани според породата (Lw, порода Laiwu), мястото за вземане на проби (Je, Jejunum; Il, Ileum; Ce, Cecum) и състоянието на съхранение на мазнини (Ob, високо съдържание на мазнини, Le, тегло с ниско съдържание на мазнини). Например, LwI10b е проба, взета от илеума на прасета с високо съдържание на мазнини Laiwu. Проби с едно и също арабско число в името на пробата бяха събрани от едно и също прасе. A. Сравнение на алфа-разнообразието въз основа на индекса на разнообразие на Шанън, групирано по място за вземане на проби и състояние на съхранение на мазнини (средно ± SEM). В сравнение с илеума и йеюнума, апендиксът има значително по-високо микробно богатство. ( Б. ) Непретеглен основен координатен анализ на UniFrac от бактериален микробиот. Пробите от тънките черва (илеум и йеюнум) и апендикса показват ясно отделяне ( ° С ) Клъстерно дърво Брей-Къртис. Обединяват се проби от същата тенденция за локализация на червата.

Изображение в пълен размер

След това изследвахме вариацията във филогенетичното разнообразие между всички тествани проби. С изключение на пробата LwIlLe.5, която се обединява в цекални проби, всички останали проби показват ясна агрегация между тънките черва (йеюнум и илеум) и сляпото черво в нетегловния анализ на главните координати (PCoA) (фиг. 1В). По същия начин, въпреки че филогенетичният състав на LwCeOb.4 от цекума е подобен на този на пробите на илеума, а пробата LwIlLe.5 от илеума показва сходство с пробите от цекула, повечето проби показват различен филогенетичен състав между тънките черва и сляпото черво в Bray C 1С). Различното бета-разнообразие на горните две проби трябва да се дължи на мастните състояния (виж по-долу). Въпреки това не наблюдавахме никаква ясна агрегация между пробите на йеюнума и илеума.

( A ) Микробен състав на ниво щам. Пробите са показани по хоризонталната ос, а относителното изобилие се показва от вертикалната ос. ( Б. ) Топлинна карта, показваща 18 рода със значителни разлики в относителното представяне между трите чревни места. Картата на картата е цветно кодирана въз основа на z-резултата в реда.

Изображение в пълен размер

Данните за метагеномно секвениране също са използвани за сравняване на структурата на микробните съобщества между йеюнума, илеума и цекума. Общо 6 запаси от луминална ДНК от трите чревни места на прасета Laiwu са използвани за изграждане на библиотеки за метагеномно секвениране. Всеки сайт предоставя два комплекта ДНК, включително един от свине с високо съдържание на мазнини, а другият от прасета с ниско съдържание на мазнини (методи). Получихме средно 11,43 Gb сурови данни за всяка ДНК група, вариращи от 9,22 Gb до 14,29 Gb (Таблица 1). След филтриране на ниските стойности за качество и замърсяване на гостоприемника, получихме 3,53 Gb до 5,01 Gb нетни данни за всяка проба. Извършихме компилация de novo на всички данни с кратка последователност, използвайки асемблера SOAPden (версия 1.06) 17. Броят на контигите на шестте ДНК проби варира от 40 420 до 139 978 с дължина на контигмента> 500 bp (Таблица 1). Програмата MetaGeneMark (MGM) беше използвана за предсказване на отворената рамка за четене (ORF) на всеки contig (вижте методите). Шест проби съдържаха общо 1 056 020 ORF, които бяха по-дълги от 100 bp (Таблица 1).

Маса в пълен размер

След това сравнихме структурата на микробната общност между трите чревни места въз основа на данни за метагеномно секвениране. Микробиотиците и на трите чревни места са доминирани от бактериалното царство, което заема над 90% от общите прочетени кратки последователности. Микробният състав беше доста подобен на състава при анализ на 16S рРНК генна последователност на ниво щам (Допълнителна фигура S2). Анализът на метагеномната последователност подобрява разделителната способност на филотипите от ниво на рода до ниво на видовете. При значителни прагове P 18, Faecalibacterium prausnitzii 19 и Butyrivibrio fibrisolvens 20 (фиг. 3А и допълнителна таблица S2).

( A ) Heatmap показва относителния брой на 21 бактериални вида, значително обогатени в йеюнума, илеума и цекума. ( Б. ) Топлинна карта на функционалните термини на CAZ, която показва значително различно обогатяване между йеюнума, илеума и цекума. GH: гликозид-хидроаза, GT: гликозилтрансфераза, PL: полизахаридна лиаза, CE: въглеводородни естерази, CBM: въглеводороден свързващ модул. ( ° С ) Термична карта на подсистемите KEGG, значително обогатена в йеюнум, илеум и цекум.

Изображение в пълен размер

Сравнение на функционалния капацитет на чревния микробиом в тънките черва и цекума

Сравнение на структурата на микробната общност сред прасета с ясно съдържание на мазнини в различни чревни позиции

Сравнителен функционален капацитет на чревните микроби между прасета с високо и ниско тегло

( A - ° С ) показват сравнения на относителния брой функционални термини на CAZy между свине с високо и ниско съдържание на мазнини в йеюнума, илеума и апендикса. GH: гликозид-хидроаза, GT: гликозилтрансфераза, PL: полизахаридна лиаза, CE: въглеводородни естерази, CBM: модул за свързване с въглеводороди. ( д - F ) показват сравнения на относителния брой на подсистемите KEGG между свине с висока и ниска свиня в йеюнума, илеума и апендикса.

Изображение в пълен размер

Анотацията KEGG е използвана за допълнително сравняване на функционалния капацитет на чревния микробиом между прасета с ниско и високо съдържание на мазнини. В йеюнума гените, свързани с метаболизма на пирувата, метаболизма на пропаноата и метаболизма на цистеин и метионин, бяха значително обогатени в метагенома на свине с високо съдържание на мазнини (Фигура 4D). Въпреки това, гените, свързани с метаболизма на пиримидина, секреторната система и биосинтезата на фолиева киселина, имат повече прасета при прасета с ниско тегло. В илеума гените, свързани с разграждането на гликан, метаболизма на пиримидин, разграждането на гликозаминогликан и биосинтеза на гликосфинголипиди, са по-разпространени при прасета с ниско съдържание на мазнини (фиг. 4Е), докато обработката и представянето на антигени, сигнален път за грип А, MAPK и ендокринните високо съдържание на мазнини прасета. В цекума адипоцитокиновият сигнален път, клетъчният антиген и храносмилането и усвояването на протеини показват по-голямо обогатяване на прасета с ниско съдържание на мазнини. Двукомпонентната система, разграждането на бензоата и бактериалният хемотаксис обаче бяха значително обогатени с високомаслени прасета (Фигура 4F).

дискусия

Проведени са няколко проучвания върху чревния микробен състав на прасета въз основа на секвениране на 16S рРНК гени 26, 27, 28. Доколкото ни е известно, има само няколко доклада за анализа на метагеномното секвениране на прасета, които могат да оценят структурата на микробната общност на видово ниво на различни места в червата. В това проучване сравнихме структурата на микробните общности на три чревни участъци, характеризирахме функционалния капацитет на микробиома на свинята отпред към задната част и изследвахме потенциалната връзка между чревния микробиом и свински мазнини, използвайки високоефективно секвениране от следващо поколение. Доколкото ни е известно, това е първият доклад за цялостен анализ на структурата на микробната общност на свине от йеюнум и оценка на чревни бактериални видове, свързани със свински мазнини.

При анализа на KEGG системата на фосфотрансфераза (PTS) е значително обогатена в тънките черва. PTS е сложна система за групова транслокация, присъстваща в много бактерии. Той транспортира захари (като маноза, глюкоза и манитол) в клетката и фосфорилира субстрата чрез фосфотрансфераза по време на транспортиране. В съответствие с този резултат, функционалните анотации на CAZγ метагеномите също разкриват, че микробиомът в тънките черва има тенденция да метаболизира хранителни вещества с малки молекули като монозахарид. Zoetendal et al. 32 също така предполагат, че бързото усвояване и ферментация на прости въглехидрати (като глюкоза и малтоза) допринасят за поддържането на микробиотата в тънките черва. Повечето гени, свързани с PTS пътя, са получени от Clostridium в тънките черва. Този резултат съвпада с факта, че 12 вида Clostridium са обогатени в йеюнуса и илеума. Известно е, че много клостридии могат да смилат суроватката и захарта, образувайки бутанол, пропионова киселина, етер и глицерин. Всъщност подсистемите за метаболизъм на бутаноата и мастните киселини са по-високи в йеюнума и илеума (фиг. 3С).

Прасетата с високо съдържание на мазнини са имали значително по-ниски нива на Prevotella spp. и Bacteroides spp. в илеума и апендикса. Иварсон и др. 42 съобщават, че количеството на бактериите Prevotella - Porphyry при растящи свине е положително корелирано с ферментационната способност на полизахаридите с къса верига на мастните киселини (SCFA). Изследване на мишки, трансплантирало човешката фекална микробиота от близнаци, които не са затлъстели, разкрива, че увеличаването на чревния микробиол на чревната SCFA засяга енергийния баланс на гостоприемника, инхибира натрупването на мазнини в мастната тъкан и повишава нивата на лептин 43. В допълнение, Bacteroides - Prevotella показват отрицателна корелация с развитието на мастната маса и възпалението при индуцирани от диета затлъстели мишки 44 .

От друга страна, микробният метаболизъм и чувствителността на хранителни вещества (метаболитна реакция) също трябва да бъдат свързани със свинските мазнини. В йеюнума свинете с високо съдържание на мазнини са обогатени за няколко метасистемни подсистеми, напр. Метаболизъм на цистеин и метионин. В сляпото черво, пътищата на KEGG, които се свързват с клетъчната подвижност (бичково сглобяване) и мембранния транспорт (двукомпонентна система и транспортери), са обогатени при свине с високо съдържание на мазнини. Съобщава се също, че тези категории KEGG са обогатени главно с дисталния микробиом на дебелото черво на затлъстели мишки при мишки и хора 5, 8, 45 и в диетата с високо съдържание на мазнини, индуцирана от мишки 39. Двукомпонентната система участва в механизма на трансдукция на сигнала и бактериален хемотаксис 46, 47 и може да се използва като метаболитен реакционен център, съчетаващ чувствителност на хранителни вещества с динамично регулиране на метаболизма на монозахаридите 48 .

В заключение наблюдавахме ясна структура на микробните съобщества между тънките черва и апендикса и идентифицирахме десетки бактериални видове, които показаха значителни разлики в относителното изобилие на всяко място на червата. Открихме ясен функционален капацитет на микробиома между тънките черва и апендикса. Предполагаме, че потенциалните патогени (напр. Escherichia spp.), Възпалителните процеси и микробния метаболизъм и чувствителността на хранителните вещества трябва да бъдат включени във високото съдържание на мазнини в прасетата. В допълнение, по-високите нива на бактерии и Prevotelly могат да инхибират развитието на мазнини и възпалението при прасета с ниско съдържание на мазнини. Тези резултати могат да предоставят интересна представа за сложността на стомашно-чревната микробна общност на прасета и могат да ни помогнат да разберем по-добре ефектите на чревната микробиота върху признаците на свинепроизводство.

Материали и методи

Събиране на луминални проби от животни и карантии

Екстракция на луминална ДНК и анализ на последователността на 16S рРНК гени

Изграждане на ДНК файлове и библиотеки за метагеномно секвениране

Два комплекта ДНК за всеки от йеюнума, илеума и цекума са конструирани с равни количества луминална ДНК от всяко животно и са осигурени за метагеномно секвениране, включително един комплект ДНК от 4 прасета с високо съдържание на мазнини и втори набор от ДНК от 4 ниски тлъсти прасета. ДНК библиотеки за метагеномно секвениране са конструирани в съответствие с инструкциите на производителя (Illumina, САЩ). Всеки набор от ДНК е конструиран като библиотека от сдвоени краища с размер на вложката

350 базови двойки. Използвахме същия протокол, както е описан от Qin et al. 56 за извършване на генериране на клъстери и секвениране на платформата Hiseq 2000 (Illumina, САЩ). Данните за метагеномно секвениране се съхраняват в архива за кратко четене на NCBI (номера за достъп в Допълнителна таблица S6).

Събиране на кратки четения

Първо обработихме суровите данни, за да филтрираме нискокачествени и заразени от хоста последователности въз основа на вътрешна процедура: I. Премахнати са записи за четене, съдържащи повече от три неизвестни бази или непрекъснати нискокачествени бази; II. Замърсителите и дублиранията на адаптера бяха пресечени; III. Показанията, нанесени на референтната геномна последователност на прасетата, бяха отстранени от допълнителен анализ. И тогава, ново сглобяването на висококачествени кратки четения беше извършено от асемблер SOAP de novo (v1.06) 17. Непрекъснатите последователности с недвусмислени кръстовища се считат за контиги.

Генна прогноза и функционална класификация

MetaGeneMark (MGM, v2.10) беше използван за предсказване на пълния набор от ORF от контигите на всяка проба 57. Използвахме cd-hit софтуер (v4.6.1), за да изключим излишните гени от всички предполагаеми ORF 58. Двойка гени с подредена дължина, покриващи повече от 90% от по-късия ген и> 95% от идентичността, бяха групирани заедно. И тогава гените, споделящи групата, се обединиха. Слятата група е представена от най-дългия ген. Останалите членове на групата бяха освободени. Набор от неподходящи гени е конструиран чрез премахване на излишъка. И накрая, нередудентните гени бяха сравнени с протеиновите последователности на базата данни KEGG 22 (v59) и CAZy 21 (ензими, активни във въглехидратите) с помощта на инструмента BLAST (v2.2.21) с e-стойност ≤ 1 × 10 -5 и праг на прага от ≥ 40%. Анотираните гени бяха включени в пътищата на KEGG. За да се проследят гените до микробите, протеиновите последователности на гените бяха сравнени с пусната база данни за бактериални референтни протеини, използвайки инструмента blastp с e-стойност ≤ 1 x 10-40. Изравняването с най-висок резултат беше запазено за допълнителен анализ.

Анализ на филогенетичен състав, базиран на данни за метагеномно секвениране

Чрез изтегляне на известни бактерии, гъби, вируси и архебактерии е създаден каталог на излишни референтни гени на свине. Еквалайзерът SOAP (v2.21) е използван за картографиране на висококачествени последователности на четене към микробни общности спрямо референтния генен каталог 59. Според теоремата за централната граница, средните стойности на микробното относително количество в тестовите проби, от които са взети пробите от популацията, следват нормалното разпределение. Използва се ANOVA за сравняване на филогенетичния състав между трите чревни места. Точният тест на Fisher беше използван за сравняване на две проби от прасета с високо и ниско тегло. Микроби с относително съотношение на изобилие 60. Всички тестове бяха проведени с помощта на софтуера STAMP 53 .

Сравнение на функционалния капацитет на чревните микроби

За сравнение на функционалния капацитет на чревните микробиоми, изобилието от анотираните гени се нормализира, както следва: (броят на четенията, картографиран на всеки ген/общ брой на чистите четения) * 100000. Относителното изобилие на всеки термин от подклас на семействата CAZy и пътищата на KEGG беше изчислено чрез сумиране на изобилието на тези гени, които бяха анотирани към функционалната подсистема. Сравненията на профилите на функционалния капацитет между свине с висока и ниска тлъстост бяха извършени чрез точния тест на Fisher. ANOVA тестът е използван за сравняване на функционалния капацитет на микробиомите между три места в червата. Z-резултатите са изчислени за изграждане на топлинните карти за показване на относителното изобилие на подсистемите KEGG и CAZy във всяка проба. Post-hoc тестът на Tukey-Kramer се използва за двойни сравнения. FDR на Story беше използван за коригиране на множество сравнения 60. Всички тестове бяха извършени с помощта на софтуер STAMP 53 .

Повече информация

Как да цитирам тази статия: Yang, H. et al. Разкриване на състава на микробната структура на общността и метагеномиката между три места в червата при прасета с отчетлива тлъстост. Sci. Представител. 6, 27427; doi: 10.1038/srep27427 (2016).

Допълнителна информация

Word документи

Допълнителна информация

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.