Нормално-фазовата хроматография е термин, използван за разделяне на молекули, използвайки взаимодействието на хидрофилни, полярни характерни групи с хидрофилната матрица на хроматографска колона, като подвижната фаза е неполярен разтворител, напр. хлороформ (HC-Cl3). Тази техника се използва за отделяне на малки органични аналити, но не е много подходяща за разделяне на големи протеини.
От друга страна, хроматографията с обърната фаза (RPC) използва хидрофобни повърхности на протеин за взаимодействие с хидрофобен лиганд. Хидрофобността на протеина е представена главно от страничните вериги на аминокиселините изолевцин, валин, левцин, фенилаланин, цистеин, метионин и триптофан. Подвижната фаза е силно полярен разтворител.
| нормална фаза | обратна фаза | |
| характерна група на лиганда | хидрофилен | хидрофобни |
| взаимодействие с матрицата | хидрофилен | хидрофобни |
| начална подвижна фаза | неполярна | силно полярна |
| елуиране | полярен разтворител | неполярен разтворител |
Матрицата в RPC е силикагел или синтетичен съполимер (полистирол), който може да издържи на по-високо работно налягане. По-малките топки осигуряват по-добра разделителна способност. Изборът на лиганд зависи от хидрофобната природа на протеина, който трябва да се пречисти. Матриците с дълга хидрофобна странична верига (напр. С18) свързват протеините много плътно, докато С4 веригите, респ. ароматната фенилна група, са по-свободни в връзката, така че те свързват само силно хидрофобни протеини. Като цяло е добре да започнете с матрица с ниска хидрофобност.
Чрез намаляване на полярността на подвижната фаза - чрез постепенен обмен за неполярен органичен разтворител, взаимодействието на хидрофобните области на протеините с матрицата намалява и настъпва тяхното елуиране. Колкото по-хидрофобен е протеинът, толкова по-голям е обемът на органичния разтворител, който трябва да се използва за елуирането му. Най-често използваният разтворител е ацетонитрил (H3C-C≡N) или метанол (H3C-OH).
След уравновесяване на колоната, нанесете протеиновия разтвор. В колоната се улавят само хидрофобни молекули. Постепенно увеличавайки концентрацията на органичния разтворител (0-100%), постигаме постепенно изместване на протеините от матрицата. Най-силните взаимодействия могат да бъдат спрени само след няколко стъпки измиване със 100% разтворител. И накрая, отново уравновесете колоната с разтвор с полярен характер, или органичен разтворител с много ниска концентрация.
Предимството на хроматографията с обратно фаза е възможността за разделяне на широк спектър от молекули, включително заредени и полярни молекули, стриктен контрол на условията на разделяне (тип разтворител, концентрация, рН, температура), висока стабилност и ефективност на колоната и стабилност. Този метод е подходящ за аналитични цели, но не е много подходящ за пречистване на протеини за изследване на неговите биологични свойства, тъй като органичният разтворител може да причини денатурацията му. Използва се главно в HPLC техниката, която разделя протеини под по-високо налягане на подвижната фаза. Алтернатива на RPC е хидрофобната хроматография (HIC).