елементи

абстрактно

Заден план

Деца с цианотична болест на сърцето развиват вторична еритроцитоза и тромбоцитопения чрез неизвестни механизми. Зрелите микроцити на еритроцитите могат да отразяват клинични патологии и преенуклеационни процеси на клетъчна диференциация. Това проучване оценява еритроцитните микроРНК при деца с цианотично сърдечно заболяване.

методи

МикроРНК на еритроцитите при деца със и без цианотично и ацианотично сърдечно заболяване е количествено определена от системата за йонен PGM (n = 10 на група). Диференциалната експресия се потвърждава чрез количествена PCR (qPCR; n = 20 на група).

резултатът

Mir-486-3p, mir-486-5p и mir-155-5p бяха увеличени при пациенти с цианотична болест на сърцето в сравнение с пациенти без сърдечни заболявания: множество разлики (95% доверителен интервал): mir-486-3p: 1, 92 (1, 14 –3, 23), P = 0, 011; mir-486-5p: 2, 27 (1, 41–3, 65), Р 108 клетки, използващи пълна кръвна картина. Обхватът на размера на микроРНК беше потвърден и 2 ng РНК беше количествено определена с помощта на биоанализатор и комплект Agilent Small RNA (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния).

Допълнителни ДНК библиотеки са конструирани с помощта на комплект Ion Torrent RNA-seq v.2 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) за малки РНК библиотеки според инструкциите на производителя и тяхната чистота и концентрация са потвърдени с помощта на Bioanalyzer с комплект Agilent DNA (Agilent Технологии).

Последователността на библиотеките на MicroRNA беше извършена върху чип 318, използвайки система за Ion Personal Genome Machine (ThermoFisher Scientific). Всички необработени четения бяха автоматично съкратени, за да се премахнат адаптерите, подравнени към човешкия геном (hg19 GRCh37) и анотирани с Torrent Suite 1.5 (TMAP) с параметри по подразбиране. Малките и некодиращи РНК бяха класифицирани според типовете гени. Идентифицирахме последователности с базата данни на miRBase 21 (//www/mirbase.org/) microRNA.

Изолиране на обща РНК и qPCR (фаза на валидиране)

Извършихме qPCR, за да определим зрялата микроРНК и да проверим резултатите от последователността на следващото поколение. Общата РНК беше извлечена от 2,7 ml пациентски кръвни клетки с помощта на RNeasy Plus Mini Kit и RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) в съответствие с инструкциите на производителя. РНК се определя количествено от 1,0 х 108 клетки с помощта на квантовия флуорометър (Promega KK, Токио, Япония) и концентрацията на всяка проба е 0,2 ng/μl. Малки РНК молекули, 5'-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3 ', бяха обогатени в проби и използвани като контрола.

Допълнителна ДНК беше получена с помощта на ABI Taqman комплект за усъвършенстван микроРНК комплементарен ДНК синтез (ThermoFisher Scientific). Анализът на qPCR беше извършен с помощта на Step One Plus (ThermoFisher Scientific). Използва се 40-кратно усилване при прага на цикъла (Ct стойности = 40). Изключихме микроРНК от груповите сравнения, когато в групата бяха наблюдавани неопределени проби (стойности на Ct> 40) над три проби. Методът ACCt е използван за анализ на стойностите на израза.

Статистически анализ

Емпиричен анализ на дигитална генна експресия с помощта на CLC Genomic Workbench версия 8.5.1 (Qiagen) беше използван за сравняване на резултатите от експресията на микроРНК от секвениране от следващо поколение. P-стойностите, коригирани за фалшиви находки (FDR-P стойности) по-малко от 0,05, се считат за значими в анализа.

Стойностите на експресията на qPCR бяха сравнени чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от post hoc анализ на Tukey. Тригруповите променливи бяха подложени на нормален тест за определяне на разпределението на данните. Обикновено разпределените данни се изразяват като средни стойности (SD), а нестандартно разпределените данни се изразяват като медиана на първия и третия квартил (квартил 1 и квартил 3). Променливите бяха анализирани с помощта на множествен тест за сравнение на Tukey за нормално разпределени данни и тест на Dunn за нормално разпределени данни. Стойностите на Р под 0,05 се считат за значими. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на Stat-Flex версия 6.0 (Artech, Осака, Япония) и Graph Pad Prism 7.00 (Graphpad Software, La Jolla, CA).

Ние изчисляваме, че 10 пациенти на група са подходящият размер на пробата за проучвателната фаза въз основа на предишно проучване (20, 21). Оценката на размера на извадката за фазата на валидиране на qPCR се основава на a = 0,05, β = 0,2 и размера на ефекта = 0,5, с три групи, използвайки G * мощност 3.1.9.2 (//www.gpower.hhu. De /) . Изискваха се четиринадесет пациенти на група. Поради това включихме 20 пациенти в групата.

резултатът

Последователност от следващо поколение (фаза на проучване)

Маса в пълен размер

вторичната

Вулканична графика на всяка група сравнение и топлинна карта на трите групи. ( а ) Съобщават се имена на микроРНК с коригирани с FDR стойности на Р (стойности на FDR-P) по-малко от 0,05. МикроРНК са разпознати като последователности на щам. За mir-1260a и mir-1260b, веригите на стъблото и зрелите последователности показват едно към едно съответствие. Използваната база данни за microRNA беше miRBase 21 (//www/mirbase.org/). ( б ) Цялата топлинна карта е показана вдясно. Областта с висок израз е удължена вляво. Mir-486-1 и mir-486-2 ясно показват контраст при цианотични вродени сърдечни заболявания и вродени сърдечни заболявания в сравнение с контролната група. FDR, невярна констатация.

Изображение в пълен размер

qPCR (фаза на проверка)

Маса в пълен размер

Диференциални микроРНК в сравнение от три групи, потвърдени от qPCR. Mir-486-3p, mir-486-5p и mir-155-5p са значително увеличени в групата на цианотичните вродени сърдечни заболявания. * Р + клетки (нагоре от хемопоетичната диференциация) и инхибира потискането на нормалните CD34 + клетки in vitro и in vivo (23). Счита се, че увеличеният mir-486-5p е механизъм за компенсиране на хроничната тъканна хипоксия чрез увеличаване на циркулиращите хемоцити. Децата с ацианотична болест на сърцето не са имали късо отдясно наляво, но често са страдали от хронична тъканна хипоксия поради системна хипоперфузия, причинена от късо от ляво на дясно. Следователно увеличаването на циркулиращите хемоцити и обема на кръвта може да бъде по-изгодно като компенсаторен механизъм за повишаване на mir-486-3p и mir-155-5p (след хемопоетичната диференциация) при наличие на вродено сърдечно заболяване. В резултат на това е в съответствие с тенденцията, че децата с ацианотична болест на сърцето обикновено не развиват еритроцитоза или тромбоцитопения (4).

Mir-155 е микроРНК, индуцирана от хипоксия (24, 25). Той модулира мегакариопоезата и свръхекспресията му инхибира диференциацията на мегакариоцитите чрез регулиране на транскрипционните фактори Meis-1 и Ets-1 (26). Следователно свръхекспресията на mir-155 може да обясни еритроцитозата и тромбоцитопенията при деца с цианотични сърдечни заболявания. Известно е също, че Mir-155 регулира хексокиназа II и увеличаването му насърчава производството на хексокиназа II и протеини (27). Анаеробната гликолиза осигурява предимно енергия на еритроцитите, тъй като митохондриите се отстраняват от ретикулоцитите в последния етап на диференциация на еритроцитите (28).

Интересното е, че mir-155 не само улеснява еритроцитозата, но и анаеробната гликолиза в еритроцитите, което от своя страна насърчава адаптацията към хипоксия. В допълнение, mir-155 се експресира в лимфоцити, ендотелни клетки и гладкомускулни клетки (29, 30, 31). Наскоро е доказано, че mir-155 има както антиангиогенни, така и проартериогенни функции чрез рецептора за ангиотензин II тип 1 в ендотелните клетки и супресора на цитокиновия сигнален рецептор 1 в макрофаги (32). Когато децата с цианотично сърдечно заболяване развият колатерална циркулация, като основната аортобелодробна колатерална артерия, mir-155 може да улесни неоваскуларизацията.

Въпреки че са предложени обяснения за патологичните състояния на цианотична болест на сърцето, механизмът остава неясен (4, 33, 34, 35). Свързаният с микроРНК механизъм, включващ mir-486-3p, mir-486-5p и mir-155-5p, може да бъде най-подходящото обяснение към днешна дата. Това се подкрепя от факта, че намаленият брой ретикулирани тромбоцити при цианотично вродено сърдечно заболяване, въпреки нормалните нива на тромбопоетин (4) и повишената еритропоеза, продължава след първоначално повишаване на нивата на еритропоетин (6). При мишките наскоро бе показано, че белият дроб е друго основно място на терминално производство на тромбоцити, където мегакариоцитите мигрират от костния мозък и освобождават тромбоцитите (36). Следователно десностранното късо съединение предизвиква „късо съединение“ на мегакариоцитите и може да ускори тромбоцитопенията (Фигура 3).

Схема на възможен механизъм на кръвни аномалии при вродени сърдечни заболявания. Увеличението на mir-486-5p увеличава диференциацията на CD34 + клетките (преди хемопоетичната диференциация). Увеличението на mir-486-3p и mir-155-5p индуцира диференциацията на мегакариоцитни прогениторни клетки и еритроидни прогениторни клетки (надолу по веригата от хемопоетичната диференциация). Дясно-ляво късо съединение предизвиква мегакариоцитно "късо съединение" и може да ускори тромбоцитопенията (36).

Изображение в пълен размер

Предишни проучвания показват, че хроничната хипоксия инхибира експресията и активността на Dicer, който преработва предшествениците microRNAs в зрелите им форми (37, 38, 39). По този начин, експресията на зрели микроРНК обикновено намалява с натрупването на пре-микроРНК при хронична хипоксия. За разлика от това, както mir-155, така и pre-mir-155 се увеличават с хипоксия и нокдаун Dicer (27); mir-486-3p и -5p биха могли да се държат по подобен начин в това проучване. Residual Dicer обработва преференциално такива пре-микроРНК, в противен случай тяхното разграждане би се забавило при хипоксия, но подробният механизъм остава неясен (27).

Също така остава неясно дали mir-1260a и let-7e-5p, които са намалени при деца с ацикотични сърдечни заболявания, допринасят за диференциацията на кръвните клетки. Понижаването на циркулиращия let-7e-5p е установено при пациенти с дефекти на вентрикуларната преграда, което предполага, че той играе регулаторна роля в развитието на дефекти на вентрикуларната преграда (40). По-голямата част от пациентите с ацианотична група са участвали в настоящото проучване на пациенти с дефект на вентрикуларната преграда и понижаване на регулацията на let-7e-5p също може да се наблюдава в еритроцитите. Обобщихме гени, свързани с диференциацията на кръвните клетки, които са предполагаеми цели на микроРНК в подкрепа на по-нататъшни проучвания (Таблица 3).

Маса в пълен размер

Ограничението на това проучване е, че то е било чисто наблюдателно. Не извършихме функционални анализи на значими микроРНК, които биха осигурили директни доказателства за аномалии в кръвта, възникващи при цианотични пациенти. Следователно са необходими допълнителни проучвания за изясняване на сложния механизъм на комбинацията от микроРНК. Mir-155-3p, mir-140-5p и mir-296 (-3p и -5p) бяха изключени от сравнението на трите групи qPCR за статистическа точност, тъй като няколко проби имаха недефинирани стойности на Ct (Ct стойности> 40) . Може да е по-изгодно да се промени Ct прагът за откриване на тези микроРНК. Почти половината от пробите mir-140-5p в контролната и ацианотичната групи не достигат прага, въпреки че се наблюдава амплификационна крива. Това може да се дължи на факта, че нивото на mir-140-5p обикновено е ниско и е трудно за откриване при непатологични условия. За такива микроРНК генерирането на последователности на последователности от следващо поколение може да помогне за идентифициране на промените в следите.

Друго ограничение е, че продължителността и степента на цианозата варират сред участващите цианотични пациенти, което може да повлияе на производството на микроРНК. Степените на тромбоцитопения и еритроцитоза не бяха наистина тежки в нашата цианотична група. Това може да се дължи на хирургични процедури, извършени по-рано от описаните по-рано (4, 33, 34, 41), като по този начин се ограничава продължителността на хроничната хипоксия, в съответствие със забележителното увеличение на mir-155, индуцирана от хипоксия микроРНК, при последователността на следното генериране и qPCR. В допълнение, по-ранната операция може да доведе до това пациентите, включени в цианотичната и ацианотичната групи, да са по-млади от пациентите в контролната група. В допълнение, mir-486-5p показва значителна промяна при деца с цианотична болест на сърцето. Увеличаването на нормалните CD34 + клетки и еритроидната диференциация на mir-486-5p може да прикрие ефекта на инхибиране на диференциацията на мегакариоцитите mir-486-3p и mir-155-5p. И накрая, ретикулоцитите не бяха отстранени в това проучване, въпреки че тези числа бяха сходни и в трите групи.

И накрая, нивата на експресия на няколко микроРНК в еритроцитите са значително увеличени или намалени при деца с цианотични и ацианотични сърдечни заболявания. Няколко форми, включително mir-486-3p, mir-486-5p и mir-155-5p, могат да допринесат за развитието на вторична еритроцитоза и тромбоцитопения при цианотични деца след хипоксия.

Допълнителна информация

Word документи

Допълнителна таблица S1

Допълнителна таблица S2

ВНОСКИ НА АВТОРА

NM и Yo.N.: Дизайн на проучването, набиране на пациенти, събиране на данни, анализ на данни и писане на първоначалния дизайн на ръкописа; SM, TM, TS и Ya.N.: Дизайн на изследването, интерпретация на данни и писане на оригиналния ръкопис; TT: дизайн на проучване и разработване на оригиналния дизайн на ръкописа; DIS: дизайн на изследването (надзор на статистическия подход) и критична ревизия на ръкописа за важно интелектуално съдържание; SI, SO и NT: набиране на пациенти, събиране на данни и първоначално писане на ръкописи.

Отчет за финансова подкрепа

Тази работа беше частично подкрепена с безвъзмездни средства в подкрепа на научните изследвания на японското министерство на образованието, културата, спорта, науката и технологиите (№ 26462370, 15K21287, 15K10542 и 17K11093).