омега-3

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • Материали и методи
  • Етика
  • звяр
  • Хистологична оценка
  • Екстракция на РНК и анализ на генната експресия чрез количествена PCR в реално време
  • Измерване на съдържанието на TG
  • Статистически анализ
  • резултатът
  • Характеристики на мишки, хранени с HFD със или без експериментални материали
  • Атенюираната с омега-3 чернодробна фиброза, свързана с NASH и добавянето на UDCA допълнително увеличава нейния антифибротичен ефект.
  • Омега-3 и UDCA-атенюиран хепатит, свързан с NASH
  • Натрупване на чернодробни TG омега-3 и UDCA
  • Омега-3 потиска експресията на гени, свързани с липогенезата, и добавянето на UDCA засилва този ефект.
  • Ефектът на UDCA върху NASH е свързан с намалена експресия iNOS иРНК
  • дискусия

елементи

абстрактно

Безалкохолната мастна чернодробна болест, една от най-често срещаните хронични чернодробни заболявания в света, се състои от редица състояния, които включват неалкохолен стеатохепатит (NASH). 1, 2, 3 Въпреки че простата стеатоза може да претърпи бездеен естествен ход, когато е придружена от напреднала чернодробна фиброза, тя често преминава през подобен клиничен курс като хронична инфекция с хепатит С с напреднала фиброза. 4 Въпреки това, при всички тези възможни чернодробни заболявания и смъртни случаи, все още не е намерено окончателно лечение, което да спре или обърне прогресията на заболяването.

Омега-3-полиненаситените мастни киселини (омега-3) се използват клинично за лечение на хипертриглицеридемия. 5 Има доказателства, че омега-3 потиска натрупването на триглицериди в черния дроб (TG) и намалява възпалението, като по този начин облекчава NASH при животински модели. 6, 7, 8, 9 Въпреки това липсват солидни клинични доказателства в полза на омега-3 в NASH, въпреки че липсата на значителни неблагоприятни ефекти на омега-3 прави подходящо използването му като добавка. 10, 11, 12

Съобщава се, че урсодезоксихолевата киселина (UDCA) играе благоприятна роля в експерименталния NASH поради нейните противовъзпалителни, чернодробни, защитни и антиоксидантни ефекти. 13, 14, 15, 16 Клиничните проучвания обаче не показват значимо подобрение на хепатит или фиброза при пациенти с NASH, лекувани с UDCA. 17, 18 Въпреки че отрицателните резултати могат да бъдат приписани на зле проектирани проучвания, включително неоптимална доза на лекарството и продължителност на изследването, се очаква, че комбинацията от UDCA с други агенти, като витамин Е, може да доведе до клинично значими резултати; Проучването обаче показа, че продължителната консумация на високи дози витамин Е (дневна доза 400 IU) увеличава смъртността. При тестване на комбинирана терапия трябва да се има предвид безопасността.

Реагентите, които показват благоприятни ефекти върху експерименталния NASH, често не показват значително подобрение в проучванията при хора. Следователно комбинираната терапия, която е по-безопасна и по-ефективна от което и да е от тези средства, може да има по-добри резултати в клиничните условия. По този начин, това проучване има за цел да изследва ефекта на омега-3 в комбинация с UDCA върху NASH-индуцирано хранене при мишки и да сравнява резултатите с резултатите само от омега-3, за да оцени възможността за тази комбинация като лечение за NASH.

Материали и методи

Етика

Експериментални процедури и протоколи върху животни са одобрени от Комитета по институционални грижи и употреба на животните в болница Gangnam Severance, Медицински колеж в Йонсей (номер на одобрение: 0011). Изследването е проведено в съответствие с препоръките и ограниченията на Конституционната комисия по грижата и използването на животните.

Мъжки мишки C57BL/6 (на 12 седмици) са получени от Central Lab Animal (Сеул, Корея) и поставени на 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Мишките бяха хранени с диета, състояща се от 15% безводна млечна мазнина, 1,0% холестерол и 50% захароза (диета с високо съдържание на мазнини (HFD)), която беше закупена от Picolab (Bethlehem, PA, USA). Тези мишки са били хранени с HFD в продължение на 24 седмици, когато са били разделени на три групи и са били хранени само с HFD (HFD), HFD и 70 mg kg -1 омега-3 (Pronova Biocare, Sandefjord, Норвегия; HFD/Omega -3) или HFD и омега-3 в комбинация с 20 mg kg -1 UDCA (Daewoong Pharm., Сеул, Корея; HFD/Omega-3 + UDCA) за още 24 седмици. Омега-3 и UDCA се разреждат в 0,75% Tween-80 и се прилагат перорално през сонда за 24 седмици. След 48 седмици HFD хранене със или без приложение на експерименталните вещества, мишките се умъртвяват и черният им дроб се отстранява. Проба от прясна чернодробна тъкан се фиксира в 10% буфериран формалин, а останалата тъкан се замразява бързо в течен азот и се съхранява при -80 ° C. Кръвните проби се събират чрез сърдечна пункция след мишка анестезия и се съхраняват при -80 ° C.

Хистологична оценка

Секции от проби от чернодробна тъкан, фиксирани в 10% формалин и вградени в парафинов восък, бяха оцветени с H&E и Sirius Red за хистологична оценка. Ослепеният патолог оцени слайдовете за възпаление, както е описано в предишни проучвания с незначителни изменения. 21, 22, 23 Възпалението е хистологично количествено чрез преброяване на възпалителни отлагания в 20 последователни полета с висока мощност (х 40 лещи; среден хистологичен клас, степен 0: без огнища, степен 1:24. Накратко, изображенията на червено оцветени участъци от Сириус са направено при увеличение × 10. В цветната част червеното показва фиброза, а сивото - паренхим. След интерактивно определяне на прага изображението се преобразува в двоично изображение. Размерните модели се измерват чрез директно броене на пиксели върху двоични изображения. Общата площ е сума от микроскопичните области на полето, които включват паренхим и фиброза.За всеки слайд площта на фиброзата се оценява в 20 последователни полета с висока производителност и след това се осреднява.

Екстракция на РНК и анализ на генната експресия чрез количествена PCR в реално време

Измерване на съдържанието на TG

Съдържанието на TG в черния дроб се определя количествено, като се използва търговски комплект (ab65336, Abcam, Cambridge, MA, USA), съгласно препоръките на производителя. Накратко, липидните екстракти се приготвят чрез хомогенизиране на 50 mg замразена тъкан в 5% разтвор на NP-40. Хомогенизираната тъкан се нагрява до 80-100 ° С на водна баня в продължение на 2-5 минути, след което се охлажда до стайна температура. Пробите се пречистват и разреждат (1:10) в дестилирана Н20, която се измерва при OD 570 mm съгласно инструкциите на производителя.

Статистически анализ

Всички резултати се отчитат като средно ± (sem). Данните бяха анализирани чрез непараметричен анализ (тест на Kruskal-Wallis или Mann-Whitney) или еднопосочен дисперсионен анализ с post-hoc анализ на Tukey. P

Промяната на телесното тегло през 48-те седмици от експеримента. Всички мишки са хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 24 седмици и след това са разделени на три групи. Едната група (n = 8) е хранена само с HFD (HFD), другата група (n = 8) е хранена с HFD и е давана омега-3 (HFD/Omega-3), а другата група (n = 8) е хранена с HFD и се прилага омега-3 в комбинация с UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) за още 24 седмици.

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Атенюирана с омега-3 чернодробна фиброза, свързана с NASH и добавянето на UDCA допълнително увеличава нейния антифибротичен ефект.

Хистологичната оценка на чернодробната фиброза беше извършена с помощта на система за анализ на изображения за оцветяване на Sirius Red. Приложение на омега-3 в дневна доза от 70 mg kg -1 с хистологично оценена HFD-усилена чернодробна фиброза (P 1 в комбинация с омега-3 допълнително атенюирана HFD-индуцирана чернодробна фиброза (P = 0,026, в сравнение с омега-3 3), Фигура 2б).

Хистологична оценка на индуцирана от диетата фиброза и възпаление при NASH. След оцветяване с H&E и Sirius Red се извършва хистологичен анализ на черния дроб, за да се оцени възпалението и фиброзата. Мишките са хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 24 седмици и след това са разделени на три групи. Едната група (n = 8) е хранена само с HFD (HFD), другата група (n = 8) е хранена с HFD и е давана омега-3 (HFD/Omega-3), а другата група (n = 8) е хранена с HFD и се прилага омега-3 в комбинация с UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) в продължение на 24 седмици. а ) Представителна хистологична оценка с използване на H&E (× 100) и Sirius Red (× 100). б ) Процентна площ на фиброза. Чернодробната фиброза се оценява чрез изчисляване на съотношението на фиброзата, използвайки система за анализ на изображението. Общата площ е сбор от областите на микроскопични полета, включително паренхим и фиброза. ( ° С ) Възпалението е хистологично количествено измерено чрез преброяване на възпалителните отлагания в 20 последователни полета с висока мощност (х 40 обектив). Средните хистологични степени се изразяват, както следва; степен 0: няма огнища, степен 1:

Съдържание на триглицериди в черния дроб. Съдържанието на чернодробни триглицериди се измерва в замразена чернодробна тъкан с помощта на търговски комплект. Мишките са хранени с високомаслена диета (HFD) в продължение на 24 седмици и след това са разделени на три групи. Едната група (n = 8) е хранена само с HFD (HFD), другата група (n = 8) е хранена с HFD и е давана омега-3 (HFD/Omega-3), а другата група (n = 8) е хранена с HFD и се прилага омега-3 в комбинация с UDCA (HFD/Omega-3 + UDCA) за допълнителни 24 седмици. * P 27, 28 и UDCA намаляват iNOS при няколко възпалителни заболявания. 29, 30 Оценихме дали благоприятният ефект на UDCA върху NASH в нашето проучване е свързан с намалена експресия на iNOS mRNA. Прилагането на омега-3 с HFD води до намаляване на iNOS mRNA (P = 0,012) и добавянето на UDCA в комбинация с омега-3 допълнително потиска експресията на iNOS mRNA (P = 0,029 в сравнение с групата само с омега-3; Фигура 3d ). ).

дискусия

Въпреки че няколко предишни проучвания съобщават, че омега-3 облекчава индуцирания от диетата NASH, 31, 32, 33 доколкото ни е известно, това е първото проучване, което отчита адитивния ефект на омега-3 и UDCA върху NASH. В съответствие с други проучвания, нашето проучване също демонстрира, че само омега-3 може да облекчи чернодробната фиброза, идентифицирана чрез намалена експресия на колаген α1 (I) иРНК. Въпреки това, приложението на UDCA в комбинация с омега-3 допълнително намалява фиброзата на нивото на иРНК и също така допълнително отслабва хистологично оценената чернодробна фиброза в сравнение с групата, приемаща само омега-3. Многократно се смята, че чернодробната фиброза е един от най-важните фактори в прогнозата за прогресията на NASH, 34, 35, 36 и адитивният ефект на омега-3 и UDCA при намаляване на свързаната с NASH фиброза прави тази комбинация потенциален кандидат за NASH лечение.

TGFβ е идентифициран като ключов регулатор на чернодробната фиброза, който упражнява своя профиброгенен ефект чрез чернодробни клетки. 37 Ролята на TGFβ сигнализирането в прогресията на свързаната с NASH фиброза също е докладвана в няколко проучвания, което я прави привлекателна цел за лечение. 38, 39 Нашето проучване показа, че омега-3 и UDCA имат адитивен ефект при потискане на експресията на mRNA на TGFβ, въпреки че според нашите резултати TGFβ не се предлага като цел за тази комбинирана терапия.

В допълнение към чернодробната фиброза, също така е известно, че възпалението играе основна роля в развитието и прогресирането на NASH. 23, 43 Въпреки че прилагането само на омега-3 не показва значителни хистологични промени, приложението на UDCA в комбинация с омега-3 води до хистологично подобрено възпаление, предизвикано от диета в NASH, което предполага адитивен ефект. Предишно проучване също показа намалена експресия на провъзпалителния цитокин TNFα след добавяне на омега-3, в съответствие с резултатите от нашето проучване.

Известно е, че натрупването на TG в черния дроб се контролира от SREBP-1c, транскрипционен фактор, който регулира липогенните ензими. 45, 46 Няколко проучвания съобщават, че добавките с омега-3 намаляват експресията на гена SREBP-1c, 6, 7, 8, 9 и скорошно проучване показва, че UDCA медиирана липогенеза чрез потискане на експресията на SREBP-1c. 47 Нашето проучване предполага адитивен ефект на омега-3 и UDCA върху потискането на SREBP-1c, въпреки че това проучване не може да разкрие адитивен ефект на UDCA върху регулирането на гените, свързани с de novo липогенезата или окисляването на мастните киселини.

Въпреки че нашето проучване не уточнява механичната роля на комбинираната терапия на омега-3 и UDCA за подобряване на NASH, потиснатото експресиране на iNOS предполага, че възможно обяснение може да бъде намалено увреждане на черния дроб от оксидативен стрес. Повишено производство на iNOS е демонстрирано при индуцирана от фруктоза чернодробна стеатоза 48, а потиснатото производство на iNOS е свързано с употребата на противовъзпалителни лекарства. В бъдеще са необходими изследвания, изследващи по-подробни механизми.

И накрая, нашето проучване демонстрира адитивния ефект на омега-3 и UDCA върху индуцирана от диетата фиброза и възпаление в NASH. Нашето проучване също демонстрира адитивния ефект на омега-3 и UDCA върху потискането на липогенния ген SREBP-1c и гена iNOS, свързан с оксидативен стрес. Тези резултати предполагат, че комбинация от омега-3 и UDCA може да бъде възможно лечение за NASH, въпреки че се изисква валидиране с помощта на различни модели на NASH и проучвания при хора.