елементи
абстрактно
Хепатоцелуларният карцином (HCC) е петото най-често срещано злокачествено заболяване и втората водеща причина за смъртност, свързана с рак в световен мащаб1. Бяха положени много усилия за подобряване на клиничното управление на пациенти с HCC; Настоящата прогноза на HCC обаче е слаба, главно поради високи нива на метастази и рецидиви, водещи до ниска обща преживяемост 2. Липсата на ефективни терапевтични средства изисква спешно разработване на нови лекарства за лечение на напреднал HCC.
Анизомицин е антибиотик, произведен от Streptomyces griseolus 15, 16. Интересното е, че е доказано, че анизомицин инхибира синтеза на еукариотни протеини и синтеза на ДНК и се съобщава, че има пряк убиващ ефект върху няколко вида туморни клетки 17, 18 Механизмите, залегнали в основата на антитуморните ефекти, свързани с анизомициновата имунна система, не са изследвани.
резултатът
Анизомицин действа като мощен директен цитотоксичен агент срещу HCC клетки
Въпреки че антитуморните цитотоксични ефекти на анизомицин (виж химическата структура на фигура 1а) са докладвани по-рано в 17, 18, прекият цитотоксичен капацитет на анизомицин в HCC клетките не е описан. По този начин ние изследвахме цитотоксичността на анизомицин в няколко HCC клетъчни линии. За да оценим това състояние, измерихме директните ефекти на анизомицин върху жизнеспособността и пролиферацията на клетките HepG2, Huh7 и SNU449, като използваме тестове за жизнеспособност на EZ-Cytox Enhanced. Стойностите на полумаксималната инхибиторна концентрация (IC50) за медиирана от анизомицин клетъчна цитотоксичност бяха изчислени от съответните криви концентрация-отговор. Важно е, че всички клетки HepG2, Huh7 и SNU449 са чувствителни към анизомицин (IC50 стойности за клетки HepG2, Huh7 и SNU449: съответно 82, 2, 118 и 138 nM; Фигури 1b-d). Нашите резултати показват, че анизомицинът е много ефективен при инхибиране на HCC клетките. За да потвърдим цитотоксичните ефекти на анизомицин, ние изследвахме клетките HepG2, Huh7 и SNU449 след култивиране с 0.2 μM анизомицин в продължение на 2 дни. Установихме, че анизомицин намалява клетъчната плътност на клетъчните линии HepG2, Huh7 и SNU449, както се наблюдава чрез светлинна микроскопия (фиг. 1д).
Инхибиращи ефекти на анизомицин върху HCC клетки. а ) химическата структура на анизомицин; % инхибиране на клетъчната пролиферация поради лечение с анизомицин в ( б ) HepG2, ( ° С ) Huh7 a ( д ) Клетките SNU449 бяха определени и данните бяха събрани от три независими експеримента. Посочените IC50 стойности бяха определени от кривата концентрация-отговор. ( д HepG2, Huh7 и SNU449 клетки бяха третирани с DMSO (контрола) или 0.2 μM анизомицин в продължение на 48 часа и бяха направени снимки под светлинен микроскоп. Показани са представителни изображения от повече от три независими експеримента.
Изображение в пълен размер
Анизомицин предизвиква селективна експресия на гени, свързани с апоптоза и имунен отговор в HCC клетки
Анизомицин предизвиква апоптоза и регулира гени, свързани с апоптоза в HCC клетки. ( а ) Диаграми на Вен показване броят на диференциално експресираните гени, свързани с апоптотичния процес и имунния отговор, регулиран в HepG2 клетки след лечение с анизомицин. Сред 1821 гена, използвани за анализ на функционалната анотация на DAVID, 166 и 127 гена са идентифицирани като свързани гени за апоптотичния процес и имунния отговор. От двете страни бяха включени 39 гена. ( б ) Представяне на топлинна карта на нивата на експресия на гени, свързани с апоптоза, които са били променени повече от 2 пъти след третиране на HepG2 клетки с анизомицин в три независими експеримента. Списъкът с гените за тази топлинна карта е даден в Допълнителна таблица 1. ( ° С HepG2, Huh7 и SNU449 клетки бяха предварително обработени с DMSO (контрола), 0, 1 и 0.2 μM анизомицин в продължение на 48 часа и апоптозата беше анализирана чрез поточна цитометрия. -ADD (апоптотични клетки) от три независими експеримента.
Изображение в пълен размер
Анизомицин индуцирана апоптоза в HCC клетки
Картата на топлината на гените, свързани с апоптоза (Фиг. 2b), показва, че експресията на 90 гена е регулирана нагоре, докато експресията на 76 гена е намалена (изброени в Допълнителна таблица 1). По този начин ние се опитахме да потвърдим дали анизомицин индуцира апоптотична клетъчна смърт в HCC клетки. Първо оцветихме третирани с анизомицин HepG2 клетки с анексин V и 7-ADD и след това извършихме поточна цитометрия. Установихме, че делът на апоптотичните HepG2 клетки (положителни за анексин V и 7-ADD) се увеличава с концентрацията на анизомицин (фиг. 2в). Подобни ефекти върху апоптозата също се наблюдават в клетки Huh7 и SNU449 след третиране с анизомицин при концентрациите, показани на фиг. 2в.
Анизомицин повишава цитотоксичността на NK клетки в HCC клетки in vitro
NK-зависими ефекти на анизомицин в модела на HCC ксенографт. а ) Схематична диаграма на дизайна на изследването и метода на инжектиране за терапевтична ефикасност. ( б ) Пет дни след инокулиране на HepG2 клетки, анизомицин (10 mg/kg) се прилага от 0 до 5 дни и от 15 до 20 дни след началото на интраперитонеалното (ip) лечение. NK клетки (5 х 106 клетки/мишка) бяха прехвърлени на мишки два пъти на 6 и 11 ден по време на периода на пауза на лечението, както е описано в Материали и методи (п = 6 мишки). Размерите на тумора са измерени в посочените дни. ( ° С ) Тумори във всяка група мишки (n = 6) на 23-ия ден от експеримента. ( д ) Точките на телесно тегло на всяка група мишки (n = 6) се измерват на всеки 3 дни.
Изображение в пълен размер
дискусия
Анизомицин, естествен антибиотик, изолиран от S. griseolus 15, 16, има инхибиторен ефект върху еукариотните рибозоми, блокирайки активността на пептидил трансферазата 24. Тези дейности на анизомицин в еукариотите могат да повлияят на различни клетъчни функции, като регулиране на протеиновата експресия, оцеляване и пролиферация 18, 25, 26. В допълнение, медиираните от анизомицин ефекти могат да бъдат медиирани чрез регулиране на вътреклетъчните сигнални пътища, като например митоген-активирана протеинкиназа (MAPK) път 26, който намалява инхибитора на каспаза, свързан с ензима, конвертиращ c-Fas домейн (IL-1) инхибиторен ензим.протеин (FLIP) и път на активиране на активация смърт 27, 28 и активиране на c-Jun и p-38 киназа 29, 30. Ясно е, че анизомицинът задейства множество противоракови сигнали в различни ракови клетки, включително HCC клетки. Задействаните от анизомицин сигнални пътища могат да се различават между различните клетки поради диференцирани вътреклетъчни сигнални скелета, които се различават между различните клетки. Въпреки че все още не е напълно разбран, анизомицин ясно влияе на клетъчния сигнал за смърт.
Въз основа на нашия анализ на геномната транскрипция с помощта на Киото енциклопедията на гените и геномите, ние открихме, че анизомицин в HCC клетките може да повлияе на много сигнални пътища, включително MAPK, рецептор на туморния некрозисен фактор и сигнални пътища на ядрен фактор kappap. (данните не са показани). Тези ефекти на анизомицин върху вътреклетъчните сигнални пътища могат да предизвикат апоптоза и да потиснат растежа на HCC клетки. Наистина, нашите резултати показаха, че анизомицин има силно инхибиращо въздействие върху растежа или директна цитотоксичност в няколко HCC клетъчни линии; освен това, тези инхибиторни ефекти на анизомицин могат да се дължат на индуцирането на апоптоза в HCC клетки. По този начин, промените в индуцираните от анизомицин множество вътреклетъчни сигнали могат да обяснят клетъчната апоптоза и цитотоксичността в HCC клетките.
Сред имуно-асоциираните гени, ние също открихме, че CD46, Vav3, ITGB2, EMP2 и ECM1 гените в HepG2 клетките са понижени от анизомицин; по-рано се съобщава, че тези гени имат функции в клетъчните метастази в различни ракови клетъчни линии 33, 34, 35, 36. Друга важна група от анизомицин-регулирани имуноасоциирани гени включва KITLG, IL-6, IL-32 и IL-3RA, които кодират цитокини и цитокинови рецептори, за да медиират потенциални сигнали за оцеляване или растеж в туморните клетки. Важно е, че повечето гени на цитокини и цитокинови рецептори са понижени чрез лечение с анизомицин в HepG2 клетки. Намаляването на регулацията на цитокините и цитокиновите рецептори може да потисне функциите на цитокини или други растежни фактори, като задейства сигнали за оцеляване синергично с намаляването на свързаните с цитокини вътреклетъчни сигнални пътища гени като STAT5B, IRAK2, RELB и JAK3 .
методи
NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl мишки са закупени от Charles River Laboratories, Inc. (Уилмингтън, Масачузетс, САЩ). Във всички експерименти използвахме женски мишки на възраст 6-8 седмици; тези мишки са били настанени в съоръжение за животни без патогени. Всички експерименти с животни са одобрени от Институционалния комитет за хуманно отношение към животните и грижи за Корея към Изследователския институт по биологични науки и биотехнологии в Корея и са извършени в съответствие с Наръчника за грижа и използване на лабораторни животни, публикуван от Националния здравен институт на САЩ.
Проучване на ксенографта
6 седмични женски мишки NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl са закупени от Charles River Laboratories, Inc. Моделите на Xenograft се определят чрез подкожно инжектиране на 1 х 106 HepG2 клетки в десните хълбоци на мишки. Пет дни след инокулацията мишките бяха разделени на случаен принцип в групи от по четирима. Анизомицин (10 mg/kg) се прилага от ден 0 до 5 и от ден 15 до 20 след началото на лечението с анизомицин по интраперитонеален (ip) път. NK клетки (5 х 106 клетки/мишка) бяха прехвърлени на мишки два пъти на 6 и 11 ден по време на периода на пауза на лечението. Туморите се измерват на всеки 3 дни с помощта на дебеломери и техните обеми се изчисляват по следната формула: обем (mm3) = (d2xD)/2, където d и D представляват съответно най-краткия и най-дългия диаметър на тумора.
Класификация на човешка периферна кръв и NK клетки
Периферна кръв от здрави донори е получена от кръвен център на Червения кръст. Следвахме инструкциите на Червения кръст и всички методи и протоколи, включващи използването на човешка периферна кръв, бяха одобрени от Институционалния съвет за преглед на Червения кръст. Въз основа на насоките на Червения кръст е получено информирано съгласие за участие в проучването и не е предоставена информация за донори. NK клетките бяха изолирани от пълноценна кръв до чистота над 95% чрез отрицателна селекция, използвайки коктейл за обогатяване на човешки NK клетки на RosetteSep (StemCell Technologies, Ванкувър, Канада), съгласно протокола на производителя. Изолирани NK клетки се промиват с HBSS плюс 4% фетален говежди серум (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) и се суспендират отново в MEM (Life Technologies), съдържащ 20% FBS (Life Technologies) и пеницилин-стрептомицин (Life Technologies ) при 37 ° C в 5% CO 2.
Анализ за цитотоксичност на NK клетки
Клетъчна култура и реактиви
HepG2 клетки са закупени от American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), а клетките Huh7 и SNU449 са закупени от Korean Cell Line Bank (Сеул, Корея). Клетките се култивират съгласно инструкциите на доставчика. HepG2 клетки се култивират в минималната есенциална среда на Eagle (ATCC), съдържаща 10% FBS (Life Technologies), 2 mM 1-глутамин и пеницилин-стрептомицин (Life Technologies) при 37 ° С в 5% CO 2. Клетките Huh7 и SNU449 бяха култивирани в RPMI1640 (Life Technologies), съдържащ 10% FBS (Life Technologies), 2 mM 1-глутамин и пеницилин-стрептомицин (Life Technologies) при 37 ° C в 5% CO 2. Анизомицин е закупен от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и разтворен при концентрация от 20 mg/ml в 100% DMSO като основен разтвор. Основният разтвор се съхранява при -20 ° С и се разрежда в среда преди всеки експеримент. Крайната концентрация на DMSO не надвишава 0,1% по време на това проучване (всички контролни групи получават 0,1% DMSO). Антитела срещу каспаза 3, PARP и β-актин са закупени от Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).
Микрочипове и анализ на данни
Анализи на клетъчната жизнеспособност и пролиферация
Клетъчната пролиферация беше оценена с помощта на комплекта за анализ на EZ-Cytox Enhanced клетъчна жизнеспособност от ITSBIO (Сеул, Република Корея). Накратко, подходящ брой клетки се поставят във всяка ямка на 96-ямкова плака и се излагат на различни концентрации на анизомицин в продължение на 48 часа. Впоследствие се добавя реагент на тетразолиева сол и клетките се инкубират в продължение на 2 часа. В края на инкубацията абсорбцията във всяка ямка се измерва при 450 nm с помощта на четец за микроплаки. Относителната жизнеспособност на клетките (%) се изчислява, като се използва уравнението OD T/OD Cx 100% (където ODT представлява абсорбция в лекуваната с лекарства група, а ODc представлява абсорбция в контролната група). Средната инхибиторна концентрация (IC50) се определя като концентрацията на лекарството, необходима за инхибиране на 50% от клетките в сравнение с контролите. Стойностите на IC50 бяха определени от кривата концентрация-отговор.
Антитела и поточна цитометрия
За анализ на апоптотични клетки, клетките се оцветяват с моноклонални антитела към човешки CD56-алофикоцианин, 7ADD и анексин V (BioLegend, Сан Диего, Калифорния, САЩ), съгласно протокола, предоставен от производителя. Накратко, клетките бяха оцветени с античовешки анти-човешки CD56-алофикоцианинови моноклонални антитела върху лед в продължение на 10 минути, измити с подходящ обем охладен буфер за свързване на анексин V (BioLegend) и ресуспендирани в охладен буфер за охлаждане на анексин V (BioLegend). наличието на анексин V и 7ADD. Клетките се инкубират върху лед в продължение на 30 минути, промиват се с охладен буфер за свързване на анексин V и се анализират. Данните за оцветяване са събрани с помощта на FACSCanto II цитометър (BD Biosciences).
Сортиране на клетки
HepG2 клетки се култивират в присъствието или отсъствието на 0.2 цМ анизомицин в продължение на 2 дни и се събират за брой клетки. След това 1 х 10 7 HepG2 клетки се култивират съвместно с 1 х 10 7 NK клетки в продължение на 2 часа и се събират чрез центрофугиране при 1000 об/мин за 5 минути. Клетките се оцветяват с анти-човешки CD56 моноклонални антитела (BioLegend), промиват се и се суспендират отново в PBS, съдържащ HBSS, допълнен с 4% FBS (Gibco). CD56-отрицателни HepG2 клетки бяха изолирани до почти 100% чистота с помощта на цитометър Aria (BD Biosciences).
Обща РНК изолация и верижна реакция на полимеразна обратна транскрипция в реално време (qPCR)
Клетките се приготвят, както е описано по-горе. Общата клетъчна РНК се изолира, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen). RT-PCR в реално време се извършва, като се използва РНК (20 ng) като шаблон, qScript SuperMix cDNA за стъпката на обратната транскрипция и PerfeCTa qPCR FastMix, UNG и ROX за PCR (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). Наборите за грунд и сонда (маркирани с FAM/VIC) са закупени от Applied Biosystems (Waltham, MA, USA). Резултатите бяха нормализирани до стойности, получени за GAPDH, както бяха открити с помощта на TaqMan GAPDH контролни реагенти (Applied Biosystems). QPCR в реално време се извършва на дублирани проби, използвайки ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). За клетките от всеки донор относителните нива на експресия въз основа на 2-ACT стойности се изразяват като проценти спрямо стойностите, получени за подгрупата с най-висока експресия.
Western blot анализ
Клетките бяха суспендирани в модифициран RIPA лизисен буфер (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 0,5% натриев дезоксихолат, 0,1% натриев додецил сулфат [SDS] и 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], съдържащ коктейл с протеазен инхибитор (Roche, Mannheim, Германия) и фосфатазни инхибитори (1 mM натриев флуорид и 2 mM натриев живачен ацетат) върху лед в продължение на 30 минути и центрофугиран при 15 000 xg в продължение на 30 минути, за да се получат лизати от цели клетки. След това протеините (10 до 20 μg) се разделят чрез SDS-полиакриламиден гел електрофореза върху 8 до 12% гелове и се прехвърлят в мембрани от поливинилиден дифлуорид (Millipore, Bedford, MA, USA). Western blot се извършва с първични антитела срещу каспаза 3, PARP и β-актин (Cell Signaling Technology) и конюгирани с пероксидаза анти-миши или заешки вторични антитела. Протеините се визуализират с Enhanced Chemiluminescence Plus реагенти (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, САЩ).
Статистически анализ
Дисперсионният анализ е използван за множество сравнения. Бяха проведени несдвоени t тестове, за да се анализират разликите между двете групи. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на софтуерния пакет Prism (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Разликите с р стойности от 0,05 или по-малко се считат за значими.
Благодаря
Тази работа беше подкрепена с безвъзмездна помощ от Националния правителствен изследователски съвет за наука и технологии (NST) (MSIP; номер на гранта CRC-15-02-KRIBB).
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.