елементи
абстрактно
Панкреатичният дуктален аденокарцином (PDAC) е четвъртата водеща причина за смъртност от рак в Съединените щати, като отчита приблизително 40 000 смъртни случая годишно. Неутралната прогноза на PDAC се дължи до голяма степен на късното диагностициране. В момента най-чувствителната диагноза на PDAC изисква инвазивни процедури, като ендоскопска ултрасонография, която има свои собствени рискове и точност, която е силно зависима от оператора. Тук използвахме общите характеристики на солидните тумори, киселинна микросреда, която се генерира като страничен продукт от метаболизма, за да разработим нов подход за използването на вградени рН (ниски) вложени пептиди (pHLIP) за PDAC изображения. Ние показахме, че флуоресцентно маркираният pHLIP може да локализира и специфично да открие PDAC в човешки ксенотрансплантати, както и PDAC и PanIN лезии в генетично модифицирани модели на мишки. Този нов подход може да подобри откриването, диференциалната диагноза и фазирането на PDAC.
Приблизително 45 000 американци са диагностицирани с панкреатичен дуктален аденокарцином (PDAC) всяка година, а честотата на PDAC нараства 1. От 70-те години обаче е постигнат малък напредък по резултатите от пациентите с PDAC. Основата на терапията е хирургична резекция; обаче само 20% от пациентите отговарят на условията за резекция поради наличието на напреднало заболяване по време на диагностицирането 2. Липсата на специфични симптоми (поради физическото местоположение на органа) и липсата на чувствителни и специфични биомаркери затрудняват получаването на диагноза на ранен етап 3. Поради тези причини има спешна нужда от инструменти, които да подпомогнат ранното и специфично откриване на PDAC преди развитието на микрометастатично заболяване. Най-често използваните до момента методи на PDAC диагностика, включително компютърна томография (CT), ядрено-магнитен резонанс (MRI) и ендоскопска ултрасонография (EUS), не са в състояние да открият ранни лезии и се използват главно в стадий 3, 4 .
В настоящото проучване, вместо да използваме традиционна молекулярна стратегия за насочване, основана на изобразяване на единичен биомаркер протеин, свръхекспресиран в подмножество ракови клетки, ние оценихме по-общ подход за насочване: киселинността на туморната микросреда. Ацидозата се формира като страничен продукт от метаболизма на раковите клетки и корелира с развитието и прогресията на тумора 5, 6, 7. Изобразяването на киселата микросреда избягва често срещания проблем с хетерогенността на протеиновите биомаркери, което ограничава полезността на агентите, насочени към специфични маркери на клетъчната повърхност 8, 9. Използвахме наскоро разработени чувствителни към рН сонди, pH (ниско) вмъкване на пептиди (pHLIPs®), за да изобразим PDAC при мишки. PHLIP са водоразтворими мембранни пептиди, които се вмъкват в липидния бислой на мембраните и образуват трансмембранна спирала само в киселата извънклетъчна микросреда, както при тумори 10, 11, 12, 13. Ние показахме, че флуоресцентно маркирани pHLIP сонди откриват PDAC тумори, метастази и PanIN лезии в предклинични миши модели на PDAC. Получените данни предоставят критични доказателства за принципа, подкрепящ по-нататъшното развитие на този нов подход, който в крайна сметка ще доведе до клиничен пробив за ранно откриване и диагностициране на PDAC.
резултатът
Целта на нашето проучване е да се демонстрира възможността за извънклетъчна киселинност за PDAC изображения в различни туморни модели. За да постигнем тази цел, използвахме чувствителен към рН WT-pHLIP пептид и неговия контрол, 2K-WT-pHLIP (Таблица 1), които бяха добре валидирани в други туморни модели 13, 14, 15, 16, 17. Протонируемите Asp остатъци в трансмембранната (TM) част на 2K-WT-pHLIP се заменят с положително заредени непротонируеми остатъци Lys, което намалява рН-зависимата способност на 2K-WT-pHLIP да влезе в мембраната. Освен това изследвахме насочването на PDAC с варианти pHLIP, Var3 и Var7 (вж. Таблица 1), тъй като наскоро бяха идентифицирани като нови варианти, които са много подходящи за изобразяване на киселинни тумори 12. Всички пептиди съдържат един Cys остатък за неинтегриране в мембранните краища (Таблица 1), който е конюгиран с флуоресцентни багрила Alexa546 или Alexa647. Конструкциите бяха пречистени и използвани при in vivo и ex vivo изследвания на флуоресценция.
Маса в пълен размер
pHLIP е насочен към PDAC и перитонеални метастази при ксенографти на карцином на панкреаса при човека
Представителни in vivo биолуминесцентни (A) и флуоресцентни (B) изображения на атимни голи мишки без тумор (норма, n = 5; вляво) и с тумор (ортотопичен PDAC модел с маркирани с луцифераза Capan-2 клетки; n = 5), инжектирани с 40 μM Alexa647 -WT-pHLIP в 100 μl PBS. Туморът и бъбреците са маркирани с черни и сини стрелки. Представителни изображения ex vivo на нормален панкреас и PDAC от мишки, инжектирани с Alexa647-WT-pHLIP (C). Количествено определяне на сигнала за биолуминесценция и флуоресценция на панкреаса (n = 5 на група) (D) и количествено определяне на сигнала на флуоресценция на черния дроб, бъбреците и белите дробове (E - G). Стойностите са средни ± SEM, * p = 0,0167, ** p = 0,0025.
Изображение в пълен размер
Изследването ex vivo на панкреаса при мишки без тумор и без тумор показва, че WT-pHLIP сондата е насочена специално към панкреаса, носещ тумори, но не и към нормалния панкреас (Фигура 1C, D). Сигналът за флуоресценция в панкреаса на мишки, носещи тумор, е 13,6 пъти по-висок (p = 0,0025) от флуоресценцията в нормален панкреас (допълнителна таблица 1). Чернодробните, бъбречните и белодробните сигнали също са количествено определени (Фигура 1E-G и допълнителна таблица 1). Интересното е, че сигналът в бъбреците на 24 часа след приложението на WT-pHLIP е значително по-висок при мишки, носещи тумор, отколкото при мишки без тумор (Фигура 1Е). В допълнение, за да се определи дали ацидозата може да се използва като маркер за откриване на метастази, мишки с откриваеми метастази чрез луминесцентен сигнал (Фигура 2А) се инжектират с флуоресцентно маркиран WT-pHLIP. След 24 часа инжектиране на сондата, WT-pHLIP флуоресценцията от първичния тумор и всички перитонеални метастази беше локализирана заедно с луминесцентния сигнал (Фигура 2).
Ортотопичен PDAC модел с маркирани с луцифераза клетки Capan-2, инжектирани с 40 μM Alexa647-WT-pHLIP в 100 μl PBS (+ pHLIP; n = 5) Биолуминесцентен сигнал, показващ растежа на тумора и метастази (A), се локализира съвместно с флуоресцентен сигнал, демонстриращ pH-зависимо насочване с Alexa647-WT-pHLIP (B). Припокриването на сигнала се показва на (C).
Изображение в пълен размер
pHLIP действат по pH-зависим начин за откриване на PDAC и метастази в генетично модифицирани модели на мишки (GEMM) и ранни PanIN лезии
GEMM с нормален панкреас (мишки без тумор, n = 10) или PDAC (мишки, носещи тумор, n = 10) се инжектират през опашната вена с 40 μM Alexa546-WT-pHLIP в 100 μl PBS (n = 5). ) или 40 μM Alexa546-2K-WT-pHLIP (пептидна последователност, модифицирана, за да бъде по-малко чувствителна към pH) в 100 μl PBS (n = 5). (А) Представителни флуоресцентни изображения ex vivo на панкреаса, бъбреците, черния дроб и белия дроб на безтуморни мишки (вляво) и мишки, носещи тумор (вдясно) 24 часа след инжектирането на Alexa546-WT-pHLIP. При някои мишки се наблюдават чернодробни метастази (квадрати), които корелират с увеличаване на сигнала на флуоресценция. (B - E) Количествено определяне на флуоресценция Ex vivo на мишки без тумор (n = 10) и мишки, носещи тумор (n = 10), инжектирани с Alexa546-WT-pHLIP или Alexa546-2K-WT-pHLIP. (F) Сравнение на насочване на тумора, използвайки Alexa546-WT-pHLIP и Alexa546-2K-WT-pHLIP (контрол). Стойностите са средни ± SEM, * p = 0,0159, ** p = 0,0043.
Изображение в пълен размер
(A) H&E, флуоресценция на Alexa647 сигнал (WT-pHLIP) и DAPI (ядра) на безтуморни мишки (отгоре) и мишки, носещи тумор (отдолу), третирани с 40 μM Alexa647-WT-pHLIP в 100 μl PBS (n = 5). (Б) Количествено определяне на флуоресцентния сигнал по отношение на ядрено оцветяване. Стойностите са средни ± SEM, **** стр
Представителни ех vivo флуоресцентни изображения на панкреаса (A) и количествено определяне на флуоресценцията на панкреаса (B), бъбреците (C), черния дроб (D) и белия дроб (E) от мишки без тумор (n = 10), тумор- носещи мишки (n = 10), мишки, съдържащи панни лезии (n = 5) и мишки с панкреатит (n = 5), инжектирани с 40 μM Alexa647-WT-pHLIP в 100 μl PBS или 100 μl PBS. Стойностите са средни ± SEM, * p
Накратко, тази работа предоставя основни предклинични доказателства, използващи различни модели на мишки, които насочват туморната киселинност в панкреаса, използвайки pH-чувствителни pHLIP сонди, могат да бъдат полезни за клиничното откриване на PDAC. Това отваря възможността за разработване на нови клинични протоколи за изображения за подобряване на откриването, стесняване на диференциалната диагностика и подобряване на етапа на PDAC. Други приложения на тази сонда за мониторинг на PDAC ще помогнат за подобряване на преживяемостта, тъй като тя ще може да открие повечето тумори в резектируемия стадий.
методи
Конюгиране на варианти на pHLIP с флуоресцентни багрила
Вариантите на PHLIP се приготвят чрез пептиден синтез на твърда фаза, използвайки Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил) химия и се пречистват чрез хроматография с обратно фаза в WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory в Йейл. Всеки вариант на pHLIP се конюгира с AlexaFluor®546 и AlexaFluor®647 C5-малеимид в DMSO в съотношение 1: 1, 2 багрила: пептид и се инкубира при стайна температура в продължение на 4-8 часа. Напредъкът на реакцията се наблюдава чрез обратнофазова HPLC. Продуктите се изолират с HPLC. Идентичността на пика е потвърдена чрез SELDI-TOF масспектрометрия и аналитична HPLC. Концентрациите на конюгирания пептид се определят чрез абсорбция (за Alexa546: ε = 93 000 M-1 cm-1 и за Alexa647: e = 265 000 M-1 cm-1).
Клетъчни линии
Установената клетъчна линия на карцинома на панкреаса (Capan-2) е получена от Американската колекция от типови култури (ATCC, Manassas, VA). Клетките бяха рутинно култивирани в препоръчаната среда. Всички клетки се поддържат при 37 ° С в овлажнена атмосфера от 5% CO 2.
имуноцитохимия
Замразените тъканни стъкла бяха покрити с помощта на монтажна среда VECTASHIELD (Vector laboratories, Burlingame, CA). Секции бяха изследвани на микроскоп Zeiss Axioplan2 и изображенията бяха заснети с камера Hamamatsu ORCA-ER със софтуер Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Rockville, MD) и анализирани с помощта на Simple PCI софтуер (Hamamatsu Corporation, Sewickley, PA).
Модели на животни
За да се оцени дали pHLIP може да служи като биомаркер за изображения in vivo, бяха проведени проучвания върху имунодефицитни ксенографти на човешки панкреатичен карцином (получени от Националния институт по рака на възраст от 5 до 6 седмици) и трансгенни мишки. Животните бяха настанени в онкологичния център на MD Anderson. Всички процедури с животни са извършени в съответствие с институционалните насоки на MD Anderson Cancer Center (Хюстън, Тексас), като се използва одобреният ветеринарен протокол на институционалните комитети за грижа и използване на животните в MD University of Texas Anderson Cancer Center Мишките, използвани за изследвания с оптични образи, са хранени с диета без хлорофил.
Генетични PanINs и PDAC модели на мишки са разработени чрез кръстосване на LSL-KRas G12D мишки 32 с флоксифицирани p53 мишки 33 и панкреатични специфични cre (Pdx-1-Cre) мишки 34, за да се получат мишки, които са имали условно делеция на p53 и ендогенни нива на мутантни KRas G12D18., PDAC при тези мишки се развива 6-8 седмици след раждането 35. Братя и сестри без PDAC служеха за контрол. В допълнение, LSL-KRas G12D 32 мишки бяха кръстосани с регулиран от CreERT (Ela-CreERT) тамоксифен (Ela), регулиран от еластаза (Ela), както е описано по-горе 36, и хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 30 дни, за да предизвикат PanIN 1 лезии, както е описано над 19. LSL-KRas G12D, p53 и Pdx-1-Cre генни мишки са получени от модели на мишки за хранилището на консорциума на човешкия рак (Rockville, MD).
Изображения in vivo и ex vivo
Статистически анализ
Данните са представени като средно ± SEM. За проучвания in vivo използвахме 5 животни на група (n = 5). Статистически значимите разлики бяха определени чрез двустранен несдвоен t-тест на Student (P