тревожност

  • абстрактно
  • ВЪВЕДЕНИЕ
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • елементи
  • наркотици
  • Тест за принудително плуване
  • Тест за окачване на опашката
  • Тест на открито
  • Светло-тъмно изследователски тест
  • Авариен тест
  • EPM
  • Измерване на хормона на стреса
  • Статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Намалено депресивно поведение при мишки с дефицит на GAT1
  • Намалено тревожно поведение при нокаутиращи мишки на GAT1
  • Измерване на хормона на стреса
  • ДИСКУСИЯ

абстрактно

Депресията и безпокойството засягат милиони хора от всички възрасти, раси, религии и доходи. Молекулярната основа за развитието на тези нарушения обаче остава до голяма степен неизвестна. Нарастващите данни сочат, че системата на γ-аминомаслена киселина (GABA) е важна в патогенезата на психологичните заболявания, включително тревожност и депресия. Изследвания с използване на магнитно-резонансна спектроскопия предполагат, че еднополюсната депресия е свързана с намалени кортикални нива на GABA. Изглежда, че антидепресантите и стабилизиращите настроението лечения също повишават кортикалните нива на GABA и подобряват дефицита на GABA при пациенти с разстройства на настроението (Krystal et al, 2002). GABA рецепторите, включително GABA A и GABA B рецепторите, обикновено се считат за мишени за лечение на психични заболявания (Kalueff and Nutt, 1996). Лекарствата, използвани за такова лечение, обаче имат странични ефекти (Johnston, 1996; Tsang и Xue, 2004). Проучванията върху животни с инхибитори на поглъщане на GABA показват значителни анксиолитични ефекти, което предполага, че модулацията на усвояването на GABA може да бъде потенциална цел за лечение на психични разстройства (Sayin et al., 1992; Schmitt and Hiemke, 1999).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

елементи

наркотици

Амитриптилин, имипрамин, флуоксетин и буспирон са закупени от Sigma-Aldrich. Тиагабинът беше любезен подарък от изследователския център на Celstar за биотехнологии в Шанхай. Диазепам е закупен от Shanghai Jiufu Pharmaceutical Co., Ltd. Тези лекарства се разтварят във физиологичен разтвор преди приложение.

Тест за принудително плуване

Мишките бяха поставени в цилиндър от плексиглас (вътрешен диаметър 10 cm, височина 50 cm), напълнен с вода 25-26 ° C (височина 10 cm). Поведението на животните се оценява ръчно и времето на обездвижване се измерва по време на 5 минути експериментиране. Мишката е смятана за неподвижна, когато остава да се носи във водата, което изисква само движенията, необходими за задържане на главата над водата (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Porsolt et al., 1977a).

Тест за окачване на опашката

Животните се инжектират интраперитонеално с обем от 10 ml/kg носител (физиологичен разтвор) или антидепресант. Като антидепресанти са използвани амитриптилин (10 mg/kg), имипрамин (5 mg/kg) и флуоксетин (20 mg/kg). Четиридесет минути по-късно мишката беше индивидуално окачена за опашка от метален прът. Пръчката беше прикрепена на 50 см над повърхността на масата, покрита с мека кърпа в стая, обезопасена срещу шум. Върхът на опашката на мишката беше прикрепен към пръчката с лепяща шотландска лента. Продължителността на теста беше 5 минути. Времето на неподвижност на увисналите на опашка мишки беше измерено, както е описано по-рано (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Steru et al., 1985).

Тест на открито

Тестът на открито е извършен в съответствие с публикуваните доклади (Holmes et al., 2003a, 2003b; Mathis et al., 1994). Откритото поле представляваше квадратна арена (50 × 50 × 50 cm3) с прозрачни стени и под от плексиглас, ярко осветена от флуоресцентна таванна светлина (1,5 μmol/m2/s). Мишките бяха поставени в центъра на кутията и им беше позволено да изследват свободно в продължение на 10 минути. Мишките бяха заловени с помощта на видеокамера, монтирана над пода, и анализирани с помощта на система за видеонаблюдение (разсейващ анализатор на Morris, V 1.1 с помощта на BGB). Определеният "ръб" на арената е широк 8 cm по стената, а "средното" поле се определя като средната площ от 20 × 20 cm 2 от откритото поле, приблизително 16% от общата площ.

Светло-тъмно изследователски тест

Провежда се скрининг на светло и тъмно, както е описано по-рано (Crawley, 1981; Holmes et al., 2003a, 2003b). Апаратът се състои от полипропиленова клетка (32 × 16 × 16 cm 3), разделена на две отделения (тъмно и светло) чрез преграда с малък отвор (8 × 5 cm 2) на нивото на пода и оборудвана с инфрачервен сензор, който е използва се за наблюдение на броя на пасажите и времето, прекарано във всяка камера за всяка мишка. По време на тези експерименти таванните светлини бяха изключени. Леката половина на махалото беше отворена, прозрачна и осветена от настолна лампа (100 W). Мишките бяха поставени индивидуално в центъра на светлинното отделение, обърнато встрани от преградата и им беше позволено да изследват инструмента свободно за 5 минути. Броят на светлинно-тъмните преходи между двете отделения и общото време, прекарано в тъмното отделение бяха записани.

Авариен тест

Аварийният тест е извършен, както е описано по-рано (Holmes et al., 2003b; Smith et al., 1998; Takahashi et al., 1989). Устройството се състои от непрозрачен черен куб от плексиглас (16 × 16 × 19 cm3) с изход (6 × 4 cm2) от едната страна на нивото на пода. Този "заслон" беше поставен в открито поле (50 × 50 × 50 cm3), ярко осветено от флуоресцентна таванна светлина, с излаз, обърнат навън към откритото поле (успоредно на едната стена на откритото поле). Мишките първо бяха поставени в приют за 5-минутно привикване на затворен изход. След това отворът беше отворен, за да позволи на мишките да напуснат приюта и да изследват откритото поле за 5 минути. За всяка мишка се записва латентността, която се появява от приюта, времето, прекарано извън приюта, и преходите към откритото пространство.

ЕРМ се извършва, както е описано по-рано (File, 2001; Holmes et al., 2003a; Lister, 1987). Апаратът се състои от две отворени рамена (25 × 8 cm2) и две затворени рамена (25 × 8 × 12 cm3), простиращи се от обща централна платформа (8 × 8 cm2). Малки повдигнати пера (0,5 см) около краищата на отворените ръце предотвратяват подхлъзването на животните. Устройството е конструирано от полипропилен и плексиглас (бял под, прозрачни стени) и е издигнато на височина 50 см над пода. Мишките бяха привикнали в тестовата стая 2 дни преди теста и бяха третирани внимателно два пъти дневно за облекчаване на нервността. За експерименти с медикаментозно лечение мишките се инжектират интраперитонеално с 10 ml/kg носител (физиологичен разтвор) или лекарства, буспирон (1 mg/kg), диазепам (1 mg/kg) и тиагабин (8 mg/kg), 40 минути преди тест. EPM. Мишките бяха поставени индивидуално на централен квадрат, обърнат към отвореното рамо, и им беше позволено да изследват инструмента свободно под равномерна светлина (1,5 μmol/m 2/s) в продължение на 10 минути. Мишките бяха заловени с помощта на видеокамера, монтирана над лабиринта и анализирани с помощта на система за видеонаблюдение (разсеяния анализатор на Морис. В 1.1 с помощта на BGB). Отворени и затворени ръце (и четирите лапи в рамото) бяха отбелязани от опитен наблюдател.

Измерване на хормона на стреса

Кръв се събира от обезглавени обезглавени мишки веднага след 10 минути физическо задържане (15 минути задържане в конична тръба от 50 ml) или от почивка в домашна клетка (0900-1000) и се центрофугира през серум за събиране на серум при 1000 g за 15 минути. и се съхранява при -20 ° C до употреба.Измерванията на кортикостерона бяха извършени върху серум с помощта на кортикостеронов имуноанализ (R&D системи) в съответствие с инструкциите на производителя.

Статистически анализ

Средните стойности и SE бяха изчислени за всяка група и групите бяха сравнени, използвайки еднопосочен ANOVA, последван от t-тест. p +/+, n +/- и n -/- .

РЕЗУЛТАТИТЕ

Намалено депресивно поведение при мишки с дефицит на GAT1

В това проучване се използва тест за принудително плуване (Porsolt et al., 1977a, 1977b) и тест за окачване на опашката (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Steru et al., 1985) за оценка на тенденцията към депресивно поведение при генотипично различни групи мишки. И двете експериментални схеми се основават на наблюдението, че когато гризачите са принудени да попаднат в отвратителна ситуация, от която не могат да избягат, те спират да се опитват да избягат и стават неподвижни. Антидепресантите намаляват времето за неподвижност при тези анализи (Porsolt, 2000; Steru et al., 1987), което предполага, че тези методи могат да се използват за тестване на поведението, свързано с депресията при мишки. В теста за принудително плуване, както е показано на Фигура 1а, времето за неподвижност за мишките GAT1 -/- е значително по-ниско от времето за животни GAT1 +/- и GAT1 +/+ (F (2, 33) = 63, p -/- в сравнение с GAT1 +/+ мишки (F (2, 16) = 16, p +/+ и GAT1 +/−, но не и при мишки GAT1 -/-. Въпреки това, подобен отговор на друг трицикличен инхибитор на абсорбция, имипрамин и във всичките три групи (Фигура 1b) Тези открития предполагат, че дългосрочните промени в GABAergic хомеостазата засягат депресивно-зависимата поведенческа тенденция на мишки с възможно участие на серотонинергичната система.

GAT1 -/- мишките показаха намалено депресивно поведение при теста за принудително плуване и теста за окачване на опашката. а) Тест за принудително плуване (n = 12 на група). Поведението на генотипно различни мишки беше измерено по време на 5-минутен тест за принудително плуване. Времето на неподвижност при диви, хетерозиготни и хомозиготни мишки беше 159,4 ± 8,7 s; 98, 3 ± 7, 6 s; 13, 6 ± 5, 1 s. *** p +/+ = 6, n +/− = 7, n -/- = 6) или 10 mg/kg амитриптилин (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) или 5 mg/kg имипрамин (n +/+ = 7, n +/− = 6, n -/- = 8) или 20 mg/kg флуоксетин (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5), както е описано в Материали и методи. Времето за неподвижност е измерено по време на 5-минутен тест за окачване на опашката. ## p ### p * p ** p *** p -/- прекара повече време в централната зона и направи повече входове (F (2, 51) = 3, 79, p = 0, 029) от други две генотипни мишки. Междувременно мишките GAT1 -/- показаха хиперактивност и повишена подвижност. Този фенотип се проявява като значително увеличение на времето на смяна (F (2, 51) = 26, 3, p -/-. Има и значително по-голям брой аберации при мишки GAT1 -/- (F (2, 51) = 7, 63, p = 0,002).

Маса в пълен размер

Тъй като резултатите от експериментите в свободно поле показват, че нокаутът на GAT1 води до намалено поведение на подобна тревожност, решихме да потвърдим тези наблюдения с допълнителни тестове.

Парадигмата за изследване на светлина и тъмнина, която се основава на вроденото отвращение на гризачите към ярко осветените зони и на спонтанното изследователско поведение на животните, се използва предимно за откриване на анксиогенно поведение (Hascoet et al, 2001). GAT1 -/- мишките прекарват значително по-малко време в тъмната стая от мишки от див тип (F (2, 43) = 8.38, p

GAT1 -/- мишките показаха намалено поведение, подобно на тревожност, при тестове за скрининг и откриване на светлина и тъмнина. а) В теста светлина-тъмнина (n +/+ = 17, n +/− = 15, n -/- = 14). GAT1 -/- мишките извършиха множество светло-тъмни преходи. б) GAT1 -/- мишките прекарват по-малко време в тъмното отделение, отколкото GAT1 +/+ мишките. в) В теста за формиране (n +/+ = 6, n +/− = 8, n -/- = 7). GAT1 -/- мишките по-добре защитават преходите на открито поле. (г) GAT1 -/- мишките прекарват повече време извън убежището, отколкото GAT1 +/+ мишките. д) Първият път, когато напускаме приюта на мишките GAT1 -/-, той е по-дълъг, отколкото при мишките GAT1 +/+, но разликата не е значителна. ** p *** p +/- мишки.

Изображение в пълен размер

Резултатите от аварийния тест са показани на фигура 2в-д. Имаше значителен генотипичен ефект върху преходите на открито поле и процентното време, прекарано извън убежището, но не и върху латентността, първоначално напускаща убежището (F (2, 18) = 0,45, p = 0,65). Еднопосочен ANOVA анализ показа, че мишките GAT1 -/- са направили повече преходи в открито поле (F (2, 18) = 6.52, p = 0.007) и са прекарали повече време извън заграждението (F (2, 18) = 10, 9 ), p -/- прекарва повече време в отворено рамо (F (2, 35) = 42, но p -/- мишките имат по-малък ефект върху поведението му при увеличения тест плюс лабиринт (Фигура 3).

Нормални и предизвикани от стрес нива на кортикостерон в серума на мишки GAT1 -/-. Мишките GAT1 +/+ и GAT1 -/- бяха отстранени от домашната клетка (наивни) или изложени на физически стрес в продължение на 10 минути. Кръв се събира от мишки чрез незабавно обезглавено кървене (n +/+ = 5, n +/− = 5, n -/- = 5). Пръчките и колоните представляват средна стойност ± SEM. ** p +/- мишки.

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

GABA е най-важният инхибиторен невротрансмитер в централната нервна система (ЦНС), а GABAergic системите играят важна роля в патофизиологията на депресията и тревожността. Магнитно-резонансната спектроскопия показва, че еднополюсната депресия е свързана с намалени кортикални нива на GABA при пациенти (Krystal et al, 2002). В допълнение, тиагабин, инхибитор на GAT1, се използва за лечение на тревожни разстройства (Crane, 2003; Lydiard, 2003; Schaller et al., 2004; Schmitt and Hiemke, 1999). Тези наблюдения предоставят обосновка за изследване на промените в поведението на настроението при GAT1 -/мишки. - .

Принудителните тестове за плуване и окачването на опашката са най-често използваните животински модели за скрининг на антидепресанти. Обездвижването, отношение, което отразява състояние на „поведенческо отчаяние“, при което животните вече не избягват, е свързано с депресия, а антидепресантите намаляват времето, през което животните са неподвижни (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al. et al., 1988; Porsolt et al., 1977a). В настоящото ни проучване установихме значително намалено време на неподвижност за GAT1 -/- мишки и в двата анализа. Тези поведенчески ефекти са подобни на наблюдаваните от нас и други изследователи при животни от див тип, лекувани с антидепресанти като амитриптилин, имипрамин и флуоксетин (Фигура 1b) (Bilkei-Gorzo et al., 2002; Borsini et al., 1988) . Porsolt et al., 1977a).

За по-нататъшно изследване на ролята на GAT1 в тревожното поведение бяха избрани три анксиолитични лекарства: буспирон, диазепам, тиагабин, които имат различни молекулни цели, за да се проучи ефектът им върху мутирали GAT1 мишки, използвайки модела на поведение на EPM. Диазепам и тиагабин действат върху GABAergic системата. Диазепамът е агонист на местата на BDZ за увеличаване на тока C1 на GABA A и е бензодиазепин с понижаващи ЦНС свойства (Banfi et al, 1982; Atack, 2005). Тиагабин хидрохлорид, селективен инхибитор на обратното поемане на GABA, повишава тонуса на GABA чрез блокада на GAT1 (Nielsen et al., 1991; Rekling et al., 1990). Буспиронът, частичен агонист на серотонин 1А рецептора, също има антагонистичен ефект върху D (2) -допамин и α2-адренергичните рецептори (Gobert et al., 1999). Лечението на див тип с тези лекарства значително повишава активността в отворените ръце на анализа на EPM. Въпреки това, мишките без GAT1 -/- не са чувствителни към поведенческите ефекти на тези лекарства.

Много пациенти с големи депресивни епизоди имат дерегулиран циркаден контрол на кортизола със значително по-високи нива в кръвта, отколкото здрави индивиди (Strickland et al., 2002; Urani et al., 2005). Повишените нива на кортизол при пациенти с депресия обикновено се нормализират след успешно лечение с антидепресанти (Wolkowitz et al, 1993, 1999). Предишни проучвания показват, че класическите бензодиазепини намаляват активността на кортикалната кора на HPA (Mikkelsen et al., 2005) и ниските серумни нива на кортикостерон могат да бъдат свързани с намалена тревожност (Ferguson et al., 2004; Smith et al., 1998) . Изследвахме функцията на оста HPA при мишки GAT1 -/- чрез измерване на нивата на кортикостерон след физически стрес и по време на нормална активност. Нивата на кортикостерон са по-ниски при мишки GAT1 -/-, отколкото при мишки от див тип по време на нормална активност. Няма обаче разлики между стресираните генотипове. Това предполага, че функцията на HPA ос при GAT1 -/- мишки е променена при нормални условия, но чувствителността й към стрес може да не се промени.

И накрая, нашите резултати подкрепят хипотезата, че регулирането на функцията GAT1 засяга поведението, подобно на тревожност и депресията. Въз основа на нашите наблюдения при мишки GAT1 -/- и GAT1 +/− с отсъствие и ниска експресия на GAT-1, нашите данни предоставят информация за приноса на експресията на GAT1 за проявата на тези психични разстройства. Следователно лекарствата, които могат да регулират функцията или експресията на GAT1 с последваща модулация на GABAergic системата, могат да имат терапевтична стойност при лечението на тези психични разстройства. GAT1 -/- мишките могат да осигурят полезен инструмент за допълнително определяне на фармакологичните ефекти на антидепресантите и анксиолитиците и фармакогенетиката на депресията и тревожността.