резус

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Ултразвуково изследване и хистологични признаци на маймуни резус, хранени с алкохол
  • Плазмени характеристики на отглежданите маймуни резус, хранени с алкохол
  • Промени в експресията на чернодробни гени при маймуни резус, хранени с алкохол с чернодробна стеатоза и чернодробна фиброза
  • дискусия
  • методи
  • Администриране на животни и алкохол
  • Вземане на кръв и химически плазмени тестове
  • Ултразвуково изследване и проби от чернодробна биопсия
  • Хистологичен анализ
  • Анализ на микрочипове на експресия на чернодробни гени
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Коментари

елементи

  • Алкохолно чернодробно заболяване
  • Метаболитен синдром

абстрактно

Алкохолната чернодробна болест (ALD) е сериозен проблем за общественото здраве с големи здравни и икономически тежести. Етиологията на ALD все още не е напълно изяснена. Разработването на лекарства и терапии за ALD е затруднено от липсата на подходящи животински модели, които възпроизвеждат хистологичните и метаболитни свойства на ALD при човека. Тук ние характеризираме модел на маймуна макак на чернодробна стеатоза и индуцирана от алкохол чернодробна фиброза, който е съвместим с клиничната прогресия на биохимията и патологията при хора с ALD. Извършен е анализ на микрочипове на експресия на чернодробни гени, за да се идентифицират потенциалните молекулярни сигнатури на прогресията на ALD. Регулиране на експресията на чернодробни гени, свързани с чернодробна стеатоза (CPT1A, FASN, LEPR, RXRA, IGFBP1, PPARGC1A и SLC2A4), беше открито в нашия модел на рязане, както и намаляване на тези гени (CYP7A1, HMGCR, GCK) . и PNPLA3) и регулиране на свързаната с рак на черния дроб експресия на чернодробния ген (E2F1, OPCML, FZD7, IGFBP1 и LEF1). Нашите резултати показват, че този модел на ALD отразява прогресията на клиничните заболявания и експресията на чернодробните гени при хората. Тези открития ще бъдат полезни за подобряване на разбирането за патогенезата на ALD и ще бъдат полезни за разработването на нови терапевтични подходи и фармакологични агенти за лечение на ALD.

Индуцираното от алкохол хронично чернодробно заболяване е основна причина за глобалната заболеваемост и смъртност 1. В развитите страни до 66% от всички хронични чернодробни заболявания са причинени от консумация на алкохол, а злоупотребата с алкохол представлява почти половината от всички смъртни случаи на чернодробни заболявания 2. Следователно алкохолното чернодробно заболяване (АЛД) е сериозен проблем за общественото здраве с висока медицинска и икономическа тежест. Индуцираното от алкохол хронично чернодробно заболяване е прогресиращо заболяване с няколко хистологични етапа: мастен черен дроб (стеатоза), алкохолен хепатит, хроничен хепатит с фиброза или цироза на черния дроб и хепатоцелуларен карцином 3. Етиологията на ALD обаче не е напълно изяснена. За разлика от други чернодробни заболявания, като вирусен хепатит, лечението на ALD не се е подобрило значително през последните десетилетия2. Понастоящем няма ефективни, широко приети терапии за ALD 4, 5. Разработването на лекарства и терапиите с ALD са затруднени от липсата на подходящи животински модели, които възпроизвеждат хистологичните и метаболитни свойства на човешкия ALD2.

Профилирането на генната експресия ще дефинира видно изразени пътища и нови молекулни цели при ALD и са установени значителни промени в генната експресия на възлите при чернодробни биопсии на пациенти с ALD 15. Подобряването на нашето разбиране за патогенезата на ALD ще предостави ценна информация за стратегиите за профилактика и лечение на ALD. Следователно, за да се позволи систематична предклинична оценка на ефикасността и безопасността на кандидатите за лекарства или терапиите за ALD при човека, е важно моделите на ALD на резус макак да отразяват както клиничната прогресия на заболяването, така и генната експресия. Въпреки това, генната експресия на хронично алкохолно увреждане на черния дроб при маймуни резус не е проучена. В това проучване описахме развитието на модели на разрези на макак с чернодробна стеатоза, алкохолен хепатит и чернодробна фиброза. Също така открихме клиничното развитие на биохимията и патологията на ALD при тези животински модели. В допълнение бяха проведени анализи на иРНК, базирани на поредица от животинска чернодробна тъкан, за да се идентифицират потенциалните молекулярни сигнатури на прогресията на заболяването и да се сравнят моделите на генна експресия с човешки модели на ALD.

резултатът

Шестнадесет маймуни резус са били хранени с алкохолен разтвор в продължение на 3 години. Средният дневен прием на алкохол за тригодишен период е бил 9,6 g/kg на ден (диапазон: 6, 2–12, 1 g/kg на ден) или 24% от общия дневен прием на калории (диапазон: 16–42% ). Три контролни животни са държани на една и съща диета, но без алкохол и приемът на храна се наблюдава ежедневно.

Ултразвуково изследване и хистологични признаци на маймуни резус, хранени с алкохол

Маймуните резус са били държани на алкохолна диета в продължение на 3 години. Животните, хранени с алкохол, показват всички етапи на ALD въз основа на ултразвук и хистологични оценки. Ултразвуковото изследване на черния дроб на маймуни резус, хранени с алкохол, показва ясно изразена чернодробна стеатоза и чернодробна фиброза, за разлика от безалкохолните контроли (фиг. 1). Хистологичното изследване на оцветени с H & E чернодробни секции разкрива развитието на лека, умерена и тежка чернодробна стеатоза с некротични промени в резус-макаци, хранени с алкохол (фиг. 2). За разлика от контролните животни, чернодробните секции от маймуни резус, хранени с алкохол, показват стеатоза, включително хепатоцелуларна вакуолация и натрупване на макро- и микровезикуларни липиди в чернодробните хепатоцити (фиг. 2в-з); Наблюдавани са също възпаление и балонна дегенерация (фиг. 2ч). Освен това, хистологичното изследване на оцветени с Masson чернодробни участъци показва чернодробна фиброза при маймуни резус, хранени с алкохол (фиг. 3). Отделна маймуна прогресира през различни етапи на стеатоза и стеатохепатит.

Нормална ехография на чернодробна тъкан ( а ): чернодробната капсула е елегантна и гладка с линейно, тънко, силно ехо и има малка пролука в линейното ехо на перитонеалната стена. Чернодробните паренхимни петна са фини и равномерно разпределени, интрахепаталната канална система е нормална, текстурата е чиста и добрият звук е добър. Ултразвук на мастна тъкан на черния дроб ( б, ° С ): чернодробната капсула е елегантна и гладка, а ръбът на черния дроб е тъп. Интрахепаталните ехо са меки и плътно изтъкани с неравномерни ехо. Интрахепаталните съдове бяха значително намалени. Ултрасонограма на тъкани от чернодробна фиброза ( д - е ): чернодробна повърхност ( д ) е неправилен и грапав, а чернодробният паренхим е неравен с неправилни некротични отлагания ( д, е ).

Изображение в пълен размер

Хистологични особености в черния дроб на маймуна резус ( а, б ) и при резус маймуни, хранени с алкохол с умерено ( ° С, д ), умерено д, е ) и тежки ( ж, з ) чрез чернодробна стеатоза (хематоксилин и еозин). В чернодробните хепатоцити може да се наблюдава очевидна хепатоцелуларна вакуолация и натрупване на макро- и микровезикуларни липиди. Стрелката на фигура 2h показва инфилтрация на възпалителни клетки.

Изображение в пълен размер

Хистологични характеристики на нормални маймуни резус макаки ( а, б ) и алкохол при маймуни резус с алкохолна фиброза ( c - h ). Утаените колагенови влакна са плътно оцветени с трихрома на Masson.

Изображение в пълен размер

Плазмени характеристики на отглежданите маймуни резус, хранени с алкохол

Въз основа на оценката на хистологичните характеристики на чернодробните секции, хранените с алкохол животни са категоризирани според стадия на заболяването според тежестта: лека, умерена и тежка чернодробна стеатоза и чернодробна фиброза. Анализирани са също чернодробната функция и липидите в кръвния серум, а броят на контролните маймуни, маймуни с лека, умерена и тежка чернодробна стеатоза и маймуни с фиброза е 3, 3, 3, 6 и 3 маймуни (Фиг. 4а-з) Концентрациите на AST в серума при животни с чернодробна стеатоза и фиброза са увеличени в сравнение с контролната група (P1) за лека, умерена и тежка чернодробна стеатоза, а чернодробните фиброзни групи показват наличието на ALD при тези маймуни (Фигура 4г). Междувременно плазмените концентрации на GGT са значително повишени при маймуни с чернодробна фиброза (P

Химични параметри на серумната плазма за GGT, AST, ALT, AST/ALT, LDH, ALP, TG и CHOL ( а - ч ) за маймуни резус с нормален черен дроб (отворена линия) и резус маймуни алкохоли с лека, умерена и тежка чернодробна стеатоза (сиви ленти) и чернодробна фиброза (черна пръчка). Различните индекси над колоните показват значителни разлики (P

* Значително различни между контролните и алкохолните резус макаки маймуни с чернодробна фиброза (P

Анализ на микрочипове на промяната в експресията на чернодробни гени между контролни маймуни резус и маймуни резус с чернодробна стеатоза ( а ) и чернодробна фиброза ( б ).

Изображение в пълен размер

дискусия

И накрая, характеризирахме модел на маймуна на стеатоза на маймуна резус, алкохолен хепатит и чернодробна фиброза, който е съвместим с клиничната прогресия на биохимията, патологията и експресията на чернодробни гени при хора с ALD. Този нечовешки модел на чернодробно заболяване на приматите ще бъде полезен за подобряване на разбирането за патогенезата на ALD и ще бъде от полза за развитието на нови терапевтични подходи и фармакологични агенти за лечение на ALD.

методи

Администриране на животни и алкохол

В това проучване са използвани деветнадесет възрастни маймуни резус (на възраст от 9 до 12 години), предоставени от Kunming Biomed International. Всички животни бяха настанени индивидуално в клетки в стая за животни с цикъл на тъмнина от 12 часа светлина: 12 часа. Температурата се поддържа между 18 ° C и 26 ° C и влажността от 40% до 70%. Животните са били хранени два пъти дневно с търговска храна от маймуни (LabDiet, Harlan Laboratories, Inc., САЩ). Пресните плодове и зеленчуци се попълваха веднъж на ден. Всички процедури бяха одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животните в Kunming Biomed International и бяха извършени в съответствие с Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни. Съоръжението за животни е акредитирано от Асоциацията за оценка и акредитация на Международната лаборатория за грижи за международни грижи. Шестнадесет маймуни резус от експерименталната група получиха 24-часов достъп до подсладен захарен разтвор на етанол. Първоначалната концентрация на етанол е 5% (v/v) и концентрацията на етанол се увеличава с 5% всяка седмица, докато достигне крайна концентрация от 25%. Три контролни животни получиха свободен достъп до вода вместо алкохол.

Вземане на кръв и химически плазмени тестове

Кръвни проби бяха получени от феморалната вена на секционни маймуни, анестезирани с кетамин хлорид (10 mg/kg; Shenyang Veterinary Pharmaceutical Inc., Китай), приблизително в 9:00 ч. Сутринта, след пост от 14 часа. За химични плазмени анализи кръвен серум се отделя чрез центрофугиране при 3000 rpm. В рамките на 15 минути. Следните химични параметри на плазмата бяха измерени с помощта на автоматизиран биохимичен анализатор Roche Modular P800 (Roche Diagnostics Ltd., Базел, Швейцария): γ-глутамил транспептидаза (GGT, U/l), лактат дехидрогеназа (LDH, U/l), аспартат аминотрансфераза (AST, U/l), аланин аминотрансфераза (ALT, U/l), холестерол (CHOL, mmol/l), триглицерид (TG, mmol/l). Анализаторът на хемилуминесценция ADC CLIA 400 (Addcare, Yantai, Китай) е използван за измерване на плазмени маркери за чернодробна фиброза, който включва серумна хиалуронова киселина (HA), ламинин (LN), колаген IV (IV-C) и проколаген III N - терминален пептид (PIIINP).

Ултразвуково изследване и проби от чернодробна биопсия

На всеки два месеца се правеха ултразвукови изследвания. След минимум 6 часа гладуване животните се упояват с кетамин хлорид (10 mg/kg) чрез интрамускулно инжектиране (IM) и долната част на корема и пищяла се обръсват. Черният дроб на всички животни е изобразен транскутанно с помощта на ултразвукова система Diasus (Dynamic Imaging Ltd., Ливингстън, Шотландия, Великобритания), снабдена с линейна трансдюсер 5 до 10 MHz, която оценява развитието на чернодробно заболяване. Преди биопсията, резус маймуните се упояват чрез IM инжекция с кетамин хлорид (10 mg/kg) и морфин хидрохлорид (0.2 mg/kg, Northeast Pharmaceutical Group, Китай). След това беше извършена чернодробна биопсия с помощта на пистолет за биопсия Bard Monopty (Bard Biopsy Systems, Tempe, AZ, USA), напълнен с игла за биопсия за еднократна употреба с размери 16 и ехогенно покрит връх (Bard Peripheral Vascular, Inc. USA) с проста перкутанна преминаване в дясното долно междуконтинентално пространство под ръководството на ултразвуковата система. Пробата от чернодробна биопсична тъкан беше разделена на две равни части. Едната част беше фиксирана във формалдехид за последващ хистопатологичен анализ, а другата част беше замразена в течен азот за последваща екстракция на РНК.

Хистологичен анализ

Пробите от чернодробна тъкан, събрани чрез биопсии, бяха внимателно фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин и вградени в парафин. Вградените в парафин тъкани бяха нарязани и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E) и трихромни разтвори на Masson (Masson). Пробите бяха класифицирани според натрупването на мазнини и отлагането на колаген според предишно проучване на опитен ветеринарен патолог, който беше заслепен от лечението, което се дава на животните 13. Накратко, умерен резултат от мазнини (степен 1) показва, че 10 до 15% от хепатоцитите съдържат вакуоли, среден резултат от мазнини (степен 2) е присвоен, когато вакуолацията се увеличи до 15 до 30% и тежка оценка на мазнини (степен 3) е когато мазнината се разпредели в повече от 40% от хепатоцитите. Чернодробната фиброза се характеризира с наличието на плътно оцветен колагенов материал.

Анализ на микрочипове на експресия на чернодробни гени

Общата РНК от чернодробни тъкани от различни точки на биопсия, според експерименталната настройка, беше извлечена с помощта на RNeasy Micro Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). Качеството на РНК се определя чрез спектрометрия на агарозен гел и електрофореза пред PCR полета. Обратната транскрипция беше извършена с

1 μg РНК, използвайки RT2 First Strand Kit (SABioscience, MD, САЩ). Експресията на чернодробния ген се определя, като се използва RT2 Profiler ™ Human Fatty Liver Liver Array и Human Arcer Cancer PCR Array (Qiagen, Frederick, MD, USA). Целевата група от 84 чернодробни гена включва гени, участващи в регулирането на адипокиновата и инсулиновата сигнализация, метаболитни ензими и транспортери, а гените, участващи в възпаление и апоптоза, са използвани за оценка на тъканите от животни, категоризирани според хистопатологичните критерии, за да покажат характеристики, определени по етапи чернодробна стеатоза., която профилира експресията на 84 гена, участващи в прогресията на хепатоцелуларния карцином и други форми на хепатокарциногенеза, беше използвана за оценка на тъкан от животни, категоризирани според хистопатологични критерии, за да се изобрази фиброза на черния дроб. Експресионната кинетика на 84-те ключови гена, участващи в потенциални мастни чернодробни биомаркери и рак на черния дроб, бяха анализирани едновременно от всяко PCR поле, използвайки онлайн RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis Template v4.0 софтуер (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ).,

Статистически анализ

Химичните плазмени параметри са изразени като средно ± SEM. Параметрите на химичната плазма (GGT, AST, ALT, AST/ALT, CHOL, TG и LDH) в различни групи са анализирани чрез еднопосочен ANOVA (софтуер SPSS, SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ) и най-малко значима разлика ( LSD). Тестът е използван за идентифициране на разликите. Тестът на Student е използван за откриване на разлики в плазмените нива на плазмените маркери между контролната и експерименталната групи. За всички анализи P беше