хипертрофия

  • абстрактно
  • Основното
  • методи
  • Вземане на проби.
  • Имуноблот анализ на MCD, ACC и AMPK.
  • Избор на проби.
  • Анализ на данни.
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Демография на пациента.
  • Възрастни промени в експресията на MCD.
  • Възраст-зависими промени в експресията на АСС и фосфорилирането.
  • Свързани с възрастта промени във възрастовата експресия и фосфорилиране на AMPK.
  • Ефекти на миокардната хипертрофия върху експресията на MCD и експресията на ACC и AMPK и фосфорилирането.
  • ДИСКУСИЯ
  • Ограничения за проучване.
  • Терминологичен речник

абстрактно

След раждането драстичното намаляване на нивата на CoA в малонил води до бързо узряване на окисляването на мастните киселини. По-рано показахме, че намаляването на малонил CoA се дължи на повишена активност на малонил CoA декарбоксилаза (MCD) и намалена активност на ацетил CoA карбоксилаза (ACC), ензими, които разграждат и синтезират малонил CoA. Намалената активност на АСС съответства на повишена активност на 5'-АМР-активирана протеин киназа (АМРК), която фосфорилира и инхибира АСС. Тези промени се забавят от хипертрофия на миокарда. Тъй като скоростта на окисляване на мастните киселини може да повлияе на способността на сърцето да се противопоставя на исхемично увреждане, ние изследвахме експресията на MCD, ACC и AMPK в сърцето на новороденото. Вентрикуларни биопсии са получени от деца, подложени на сърдечна хирургия. Имуноблот анализът показва положителна връзка между експресията на MCD и възрастта. За разлика от това се наблюдава отрицателна корелация между експресията на ACC и AMPK и възрастта. Всички камерни проби показват известна степен на хипертрофия, но не са открити разлики в ензимната експресия между умерена и тежка хипертрофия. Това предполага, че повишената експресия на MCD и намалената експресия на ACC и AMPK са важни регулатори на съзряването на окислението на мастните киселини в сърцето на новороденото.

Основното

Регулиране на метаболизма на мастните киселини в сърцето. АСС се инактивира чрез фосфорилиране от P-AMPK. Активният АСС катализира карбоксилирането на ацетил КоА до малонил КоА, което инхибира ограничаващия скоростта ензим на митохондриалните мастни киселини, CPT-1. MCD катализира декарбоксилирането на малонил CoA до ацетил CoA, като по този начин премахва инхибирането на CPT-1, (a) активната форма, (i) неактивната форма, (+) стимулира, (-) инхибира.

Изображение в пълен размер

Окисляването на мастните киселини в сърцето може да бъде повлияно от различни патофизиологични състояния, като хипертрофия на миокарда. При възрастни миокардната хипертрофия е свързана с драматични промени в енергийния метаболизъм, особено с преход към фетален гликолитичен фенотип на плода (20–22). При новороденото хипертрофията на миокарда забавя съзряването на окислението на мастните киселини поради постоянно повишени нива на CoA малонил, повишена активност на АСС и намалена активност на AMPK (17). Това забавяне на съзряването на окисляването на мастните киселини може да доведе до сърцето на новороденото, което разчита на гликолизата като основен източник на АТФ, а метаболитни промени се наблюдават и в хипертрофираното сърце на възрастни (20-22).

Хипертрофия на миокарда може да се появи при педиатрични пациенти с вродени сърдечни дефекти като фалот тетралогия (TOF), хипопластичен синдром на ляво сърце (HLHS), атриовентрикуларни септални дефекти (AVSD), камерни септални дефекти (VSD) или запушване на десния вентрикуларен тракт. (RVOTO). Не е известно дали хипертрофията на миокарда променя експресията на ензими, които регулират нивото на Malonyl CoA и по този начин узряването на окисляването на мастните киселини в сърцето на новороденото.

методи

Вземане на проби.

Със съгласието на законния представител бяха взети 26 проби от дясната миокардна вентрикула с размери от 18 до 200 mg от бебета, подложени на сърдечна операция за коригиране на вродени сърдечни дефекти. Пробите бяха получени от проби, които обикновено се резецират и изхвърлят като част от хирургичната процедура. Извършени са операции и са взети проби в болницата на Университета на Алберта, Център за здравни науки на Уолтър К. Макензи в Едмънтън, Алберта, Канада. Етично одобрение беше дадено от Етичния съвет за изследване на етичното здраве в Университета на Алберта, файл № 4876. Всички тъкани бяха незабавно замразени в течност N2 и съхранявани при -80 ° C, докато се използват за биохимичен анализ.

Имуноблот анализ на MCD, ACC и AMPK.

За биохимичен анализ 25 ± 2 mg тъкан се хомогенизира в буфер, съдържащ 0,05 M Tris-HCl, 0,25 M манитол, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM натриев флуорид, 5 mM натриев пирофосфат, 1 mM дитиотреитол. 0,1% (обем/обем) инхибитор на протеаза на тъкани на бозайници (Sigma Chemical Co. Aldrich, Oakville, ON), 1% (обем/обем) коктейл коктейл фосфатаза I (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON), коктейл инхибитор на фосфатаза II ( Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON) и 10% (w/v) глицерол. Хомогенатите се пречистват чрез центрофугиране и супернатантата се събира за биохимичен анализ. Количествено белтъчините бяха използвани по метода на Брадфорд. Западните имуноблотове се извършват, както е описано по-рано (16). MCD беше имуноблотиран с антиMCD антитяло (H2-40 антитяло, приготвено вътрешно). АСС се имуноблотира със заешко антифосфо-АСС (Ser79) антитяло (Upstate Cell Signaling Technologies USA, Charlottesville, VA) или конюгирано с пероксидаза стрептавивиново антитяло (KPL, Gaithersburg, MA). AMPK беше имуноблотиран с antiPhospho-AMPK антитяло (Thr 172) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) или антиAMPK антитяло (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA).

Избор на проби.

Тъй като хипертрофията на миокарда може да намали окисляването на мастните киселини по начин, пропорционален на нейната тежест (26), пробите бяха стратифицирани въз основа на тежестта на хипертрофията. Хипертрофията е класифицирана от леки сърдечни детски хирурзи като лека, умерена и тежка, като се вземат предвид видът на лезията и възрастта на пациента. Където е възможно, количественото определяне на дебелината на стената на дясната камера е извършено с помощта на М-режим/двуизмерна ехокардиография, или в изглед с дълга или къса ос, с водещ ръб към предния ръб на същото ниво като мускулите на левокамерната папила в края на диастолата. В случаите, когато не са налични ехокардиографски записи, хипертрофията се категоризира изключително по тип лезия и възраст на пациента.

Анализ на данни.

Поради големия размер на пробата бяха извършени 3 гела за всеки ензим, който се наблюдава (MCD, P-ACC, ACC, P-AMPK и AMPK). Съществува възможност за леки промени в титрите на първичните и вторичните антитела, използвани при западна имуноблотинг. В резултат на това логаритъмът за всички необработени стойности беше взет предвид за всякакво пристрастие към данните (Фигури 2-4). Нормализирането на средната стойност ± SD за всяка група беше извършено, за да се премахнат малките разлики между отделните гелове, позволявайки директно сравнение. По този начин е получен пробен размер от 26 проби с проби от бебета на възраст от 0,2 до 10 месеца. Възраст-зависимите промени в ензимната експресия се определят чрез линеен регресионен анализ. Ако е необходимо, резултатите се изразяват като средно ± SEM. Разликите в експресията на MCD, ACC и AMPK между клинично лека и тежка хипертрофия са оценени с помощта на U-теста на Mann-Whitney. Резултатите се считат за значими в p

Нормализирана експресия на MCD в дяснокамерната миокардна тъкан при кърмачета на възраст от 0,2 до 10 месеца (n = 26), което показва зависено от възрастта увеличение на експресията на MCD (r = 0,42, p = 0,03). Вмъкването показва представителни западни имуноблоти.

Изображение в пълен размер

РЕЗУЛТАТИТЕ

Демография на пациента.

Общо 26 дяснокамерни биопсии (10 проби от пациенти и 16 проби от мъже) са получени от новородени на възраст от 5 дни (0, 2 месеца) до 10 месеца, които са подложени на хирургична корекция или на VSD, HLHS, AVSD, TOF. или RVOTO (Таблица 1). Тези проби бяха използвани за оценка на възрастово зависимите промени в експресията на MCD, както и възрастово зависимите промени в експресията на ACC и AMPK и фосфорилирането. Всички пациенти са имали някаква степен на миокардна хипертрофия. Общо се установява, че пациентите с RVOTO имат тежка хипертрофия (Таблица 1). За да се характеризират ефектите от миокардната хипертрофия върху експресията на MCD, ACC и AMPK, е избрана подгрупа пациенти (n = 5 на група) на сходна възраст (средна възраст = 3,5 месеца) с умерена или тежка хипертрофия (вж. Точка 4.8). По-долу).

Маса в пълен размер

Възрастни промени в експресията на MCD.

Първо, бяха оценени ефектите на възрастта върху експресията на сърдечен MCD, ензимът, отговорен за декарбоксилирането на малонил CoA до ацетил CoA. Наблюдавано е значително (p = 0,03) зависещо от възрастта увеличение на експресията на MCD (фиг. 2), което предполага, че докато детето узрее, увеличаването на експресията на MCD вероятно ще намали съдържанието на CoA малонил и по този начин ще дезинхибира CPT-1, в резултат пермисивни ефекти върху окисляването на дълговерижни мастни киселини на миокарда. Въпреки това, поради ограничената наличност на проби, нивата на малонил CoA в камерни биопсии не са измерени в това проучване.

Възраст-зависими промени в експресията на АСС и фосфорилирането.

Освен това бяха оценени ефектите на възрастта върху сърдечната експресия на АСС. Въпреки че сърцето изразява както 265 kD, така и 280 kD ACC изоформи, 280 kD изоформа преобладава и не сме успели да открием 265 kD изоформа чрез западна имуноблотинг. Налице е значително (p = 0,002), зависимо от възрастта намаляване на експресията на АСС (Фиг. 3), което предполага, че докато сърцето узрее, намаляването на експресията на АСС вероятно ще намали синтеза на малонил КоА. Тъй като АСС може да се фосфорилира при серин-79 и да се инхибира от AMPK, ние също измерихме нивата на Р-АСС с фосфо-специфично антитяло. Няма промяна в степента на фосфорилиране на АСС. Това предполага, че синтеза на малонил CoA и съзряването на окисляването на мастните киселини най-вероятно се регулират от нивото на експресия на АСС, а не от състоянието на фосфорилиране на АСС в сърцето на новороденото.

Нормализирана експресия на АСС в дяснокамерната миокардна тъкан при кърмачета на възраст от 0,2 до 10 месеца (n = 26), което показва възрастово зависимо намаляване на експресията на АСС (r =, 0,66, p = 0,002). Вмъкването показва представителни западни имуноблоти.

Изображение в пълен размер

Свързани с възрастта промени във възрастовата експресия и фосфорилиране на AMPK.

За по-нататъшно изследване на това, ефектите на възрастта върху експресията на AMPK бяха допълнително оценени. Налице е значително (p = 0,04) зависимо от възрастта намаление на експресията на AMPK (Фиг. 4). Няма промяна в степента на фосфорилиране (активиране) на AMPK, както се определя чрез нормализиране на P-AMPK до общото количество AMPK, открито във всяка проба от камерна биопсия.

Нормализирана експресия на AMPK в деснокамерната миокардна тъкан от кърмачета на възраст 0-10 месеца (n = 26), което показва възрастово зависимо намаляване на експресията на AMPK (r = −0,41, p = 0,04). Вмъкването показва представителни западни имуноблоти.

Изображение в пълен размер

Ефекти на миокардната хипертрофия върху експресията на MCD и експресията на ACC и AMPK и фосфорилирането.

Всички проби от камерна биопсия в това проучване показват различна степен на сърдечна хипертрофия (Таблица 1). Ограничен брой проби от камерна биопсия, класифицирани като клинично леки (n = 1) и умерена хипертрофия (n = 2), изключват всякакъв статистически анализ на възможни промени в експресията на MCD, ACC и AMPK. Ефектите от хипертрофия върху експресията на MCD, ACC и AMPK са ограничени до проби от камерна биопсия, класифицирани като клинично лека или тежка хипертрофия. Експресията на MCD, ACC и AMPK се оценява в две групи (n = 5 на група) във възрастовия диапазон от 2-6 месеца с клинично лека или тежка хипертрофия (Таблица 2). Не се наблюдава разлика в експресията на MCD, ACC или AMPK между лека и тежка хипертрофия. Въпреки това, при пациенти с тежка хипертрофия в сравнение с пациенти с умерена хипертрофия (Таблица 3), има значително (p = 0,03) намаляване на съотношението на β-AMPK (активен) към общия AMPK.

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Това проучване изследва ефектите от възрастта и хипертрофията на миокарда върху сърдечната експресия на MCD, както и върху сърдечната експресия на АСС и AMPK и фосфорилирането. Проби от вентрикуларна биопсия, получени от педиатрични пациенти на възраст от 0,2 до 10 месеца, увеличават експресията на MCD, зависима от възрастта. За разлика от тях, в зависимост от възрастта, ACC и AMPK се изразяват без никакви възрастово зависими ефекти върху фосфорилирането на някой от ензимите в сърцето на новороденото. Хипертрофията (тежка хипертрофия спрямо лека хипертрофия) не повлиява експресията на MCD или експресията на АСС и фосфорилирането. Въпреки че няма значителна разлика в експресията на AMPK между тежка и умерена хипертрофия, AMPK фосфорилирането е намалено в началото на тежката хипертрофия. Тези данни предполагат, че промените в експресията на MCD, ACC и AMPK вероятно ще подкрепят промените в съдържанието на CoA малонил (не е оценено в това проучване), особено по отношение на узряването на окисляването на мастни киселини в сърцето на новороденото по време на стареенето. Тези данни освен това предполагат, че промените във фосфорилирането на AMPK (т.е. активиране), но не и експресията на AMPK, може да са причина за разликите в скоростта на съзряване на окисляването на мастните киселини, наблюдавани при различни степени на хипертрофия на миокарда в сърцето на новороденото.

Изследването на експресията на MCD разкри възрастово зависимо увеличение след раждането. Тази повишена експресия вероятно ще регулира съзряването на окисляването на мастните киселини, тъй като увеличаването на съдържанието на MCD може да увеличи разграждането на малонил CoA и по този начин да дезинхибира CPT 1, ограничаващия скоростта ензим на митохондриалните мастни киселини. Това се подкрепя от предишни открития в сърцето на новороденото заешко сърце, където има драматично намаляване на съдържанието на малонил CoA от 1 до 7 дневна възраст, в съответствие с 10-кратно увеличение на окисляването на мастните киселини. Само активността на MCD не се променя поради разликите в доставката на мастни киселини до сърцето на новороденото (27). Въпреки че не можахме да определим активността на MCD в камерни биопсии поради ограничения характер на пробите, предишни проучвания показаха, че активността на MCD се увеличава с увеличаване на възрастта на новороденото сърце (11). Въпреки че това проучване не оценява експресията на MCD (11), то осигурява подкрепа за потенциалната важност на промените в експресията на MCD, които са в основата на промените в активността на MCD и по този начин регулират съдържанието на малонил CoA и съзряването на окисляването на мастните киселини в сърцето на новороденото.

Експресията на MCD, ACC и AMPK при избрана група пациенти на сходна възраст не разкрива никакви разлики между лека и тежка хипертрофия. Хипертрофията е категоризирана по възраст и вид лезия след сърдечна биопсия, когато дебелината на стената на дясната камера не се влияе от ин виво сърдечните хемодинамични и параметри на налягането. Въпреки че предишен доклад описва забавяне на съзряването на окисляването на мастни киселини в свински сърца с неонатална хипертрофия (до 21-дневна възраст), дължащо се отчасти на поддържане на ACC активност и намалена експресия на AMPK каталитичната α-субединица (17), липсата на налични образци на камерна биопсия без каквато и да е степен на хипертрофия изключва такава хипертрофия в това проучване. Интересното е, че експресията и степента на AMPK фосфорилиране не се различават между умерена и тежка хипертрофия сами по себе си, но има значително намаление на β-AMPK, тъй като тя се нормализира до наблюдаваното общо количество AMPK. Това може да предполага, че степента на хипертрофия може да повлияе на фосфорилирането и по този начин на активирането на AMPK. Този ефект на хипертрофия обаче трябва да се тълкува с повишено внимание, тъй като тази разлика, макар и статистически значима, може да не е физиологично значима, тъй като е резултат от значителни промени в общия и фосфорилиран AMPK между лека и тежка хипертрофия (Таблица 3).

Ограничения за проучване.

В заключение, това проучване демонстрира зависещо от възрастта увеличение на експресията на MCD, както и зависимо от възрастта намаляване на експресията на ACC и AMPK в проби от биопсия на дясна камера, получени от кърмачета, подложени на операция за коригиране на различни вродени сърдечни дефекти. Тъй като няма свързани с възрастта промени в фосфорилирането на АСС и АМРК, това предполага, че нивата на експресия, а не активността, могат да бъдат важни регулатори на съзряването на окислението на мастните киселини в сърцето на новороденото при наличието на различна степен на хипертрофия.,