- елементи
- абстрактно
- Въведение
- резултатът
- Клонов състав на групата HSC поради възрастта
- Функционално обръщане на стари HSC клонинги
- дискусия
- методи
- мишки
- Имунофенотипни анализи и сортиране на клетки
- Изследване на клоналността на стареенето на HSC
- Производство на iPS клетки
- Генериране и характеризиране на клонинги на специфични химерни мишки
- статистика
- Наличност на данни
- Повече информация
- Допълнителна информация
- PDF файлове
- Допълнителна информация
- Файл за преглед
- Excel файлове
- Допълнителна информация 1
- Коментари
елементи
- стареене
- хематопоеза
- Хематопоетични стволови клетки
абстрактно
Стареенето е свързано със значителни промени в соматичните/възрастни стволови клетки и лечението за противодействие на тях може да има значителни ползи за здравето. В кръвта стареенето на хематопоетичните стволови клетки (HSC) е свързано с няколко функционални дефицита. В допълнение към неотдавнашното откритие, че отделните HSC могат да бъдат предварително зададени по различен начин от млада възраст, HSC също могат да стареят асинхронно. Следователно оценката на перспективите за подмладяване на HSC изисква подход към тези HSC, които са функционално засегнати от възрастта. Тук комбинираме генетичните баркодове на стари HSC мишки с образуването на индуцирани плурипотентни стволови клетки (iPS). Това ни позволява да насочим конкретно към по-стари HSC, които показват маркирани наклонени линии, които са отличителен белег на стареенето на HSC. Функционалните и молекулярни оценки показват, че хемопоезата от тези iPS клонинги не се различава от тази, свързана с млади мишки. По този начин нашите данни осигуряват пряка подкрепа за идеята, че няколко ключови функционални атрибута на HSC стареенето могат да бъдат обърнати.
Стареенето е свързано с дълбока предразположеност към редица заболявания, които включват по-голямо разпространение на анемия, левкемия и нарушен имунитет в кръвта 1. Докато свързаните с възрастта заболявания може да се дължат на промени, които компрометират или променят функцията на зрелите ефекторни клетки, те са по-трудни за съгласуване с органи като кръв, които разчитат на присъщи краткотрайни ефекторни клетки, които се нуждаят от непрекъснато попълване 1. 2, 3. По-скоро събраните данни предполагат, че производството на подкласове на хемопоетични клетки de novo се променя с възрастта 4, 5, 6, 7, подобно на по-тесните времеви прозорци в първоначалното развитие 8. Тези открития също до голяма степен оспориха класически дефиниращите критерии за хематопоетични стволови клетки (HSC) като хомогенна популация от клетки с капацитет за диференциация за всички хематопоетични линии. По-скоро диференциалният капацитет на HSC може да бъде по-подходящо дефиниран като непрекъснат многокамерен хемопоетичен изход, който обаче не е задължително да включва производството на всички видове кръвни клетки във всички времеви моменти.
Докато много от промените в стареенето на възрастни се дължат на промени във функцията 1 на HSC, отделните компоненти на групата HSC могат да покажат значителна промяна във функция 4, 9, 10. В допълнение към различните HSC, които са предварително зададени по различен начин 5, 6, 11, което може постепенно да промени състава на HSC групата с 5, 6 години, други механизми, водещи до сегментни промени в групата HSC, включително въздействия върху околната среда, неравномерно умножаване и възстановяване Възможни са и ДНК мутации в отделни клетки. По този начин хетерогенността на отделните клетки не се взема предвид само чрез оценка на хронологично старите клетъчни популации.
Механизмите, които стимулират стареенето както на организма, така и на клетъчното ниво, привлякоха значително внимание, защото те са основните цели за намеса. Например, продължително здраве и дълголетие са докладвани при различни моделни организми чрез ограничаване на калориите и/или манипулация на осите IGF1 и mTOR 3. Освен това се предлага повишена функция на старите клетки чрез "млади" системни фактори12. Дали подобни подходи всъщност отразяват подмладяването на клетъчно ниво или по-скоро стимулират по-малко засегнатите от възрастта клетки е до голяма степен неясно. Тази загриженост се отнася и за предишни проучвания, които се доближават до перспективите за обръщане на клетъчното стареене чрез препрограмиране на соматични клетки 13, 14, 15, които обикновено не успяват да направят разлика между функционално и хронологично стари клетки. За тази цел е необходимо надеждно да се определи функцията на конкретната родителска донорска клетка, използвана за препрограмиране, което изисква оценка на ниво клонална/индивидуална клетка.
Тук ние разглеждаме тези проблеми чрез генетично баркодиране на млади и стари HSC, което позволява оценка на регенеративния им капацитет след трансплантация на клонално ниво. Това ни позволява да открием, че стареенето е свързано с намаляване на лимфоидния потенциал на HSC клонингите и увеличаване на клоновете на миелоиден потенциал. Ние произвеждаме индуцирани плурипотентни стволови (iPS) линии от функционално дефинирани стари HSC клонинги, които допълнително оценяваме за способността им да образуват кръв след повторна диференциация до HSC чрез допълване на бластоциста/морула. Нашите експерименти показват, че всички тествани iPS клонинги, включително тези, които първоначално са напълно лишени от Т- и/или В-клетъчен потенциал, функционират подобно на младите HSC в стационарно състояние (1 ° химери), въпреки че са принудени да регенерират лимфомиелоидната хемопоеза в вторични трансплантации. Тази функция отново съвпада с транскрипционните свойства, споделени с млади, а не стари HSC. Следователно ние предоставяме пряка подкрепа за идеята, че няколко функционални аспекта на HSC стареенето могат да бъдат обърнати.
резултатът
Клонов състав на групата HSC поради възрастта
В стъпки 1 и 2 младите и по-възрастните HSC бяха изолирани, баркодирани и конкурентно трансплантирани в смъртоносно облъчени млади гостоприемници. След определяне и оценка на дългосрочната хематопоеза, допринасяща от кодираните линии (стъпка 3а), периферни В, Т и миелоидни клетки, както и предшественици на BM еритроидни клетки бяха изолирани и подложени на задълбочено секвениране, за да се разкъсат техните основни баркодове ( стъпка 3б).). В същото време незрели BM клетки са изолирани от мишки, трансплантирани със стари HSC баркодове (трансплантация 1 °), на които напълно липсва възстановяване на Т-клетките (намаленото производство на Т-клетки е отличителен белег на стареенето на HSC). Баркодовете в получените iPS линии бяха изследвани за припокриване с потенциала на линиите на отделните HSC, получени в стъпка 3а. След това бяха използвани пет iPS линии за генериране на iPS химери чрез допълване на бластоцисти и морула, чиито баркодове са свързани с скосяване на миелоидни линии (стъпка 4). HSC в iPS химера бяха изследвани както за функционални, така и за молекулни параметри на кръвообразуването и тяхната ефективност беше сравнена с млади (функционални и молекулярни анализи), средна възраст (молекулярни анализи) и стари HSC (молекулярни анализи; стъпка 5).
Изображение в пълен размер
а ) Генериране на периферни Т-клетки от HSC с баркодове при 1 ° трансплантации, iPS химери и 2 ° трансплантации. Показана е средната честота (%) ± sd между всички тествани клетки (съответно n = 5 и 22 мишки за iPS трансплантации). Клетките в участъци от FACS се генерират върху единични, жизнеспособни CD45.2 +, GFP +, CD11b клетки и върху единични, жизнеспособни CD45.2 +, CD11b бластоцистни клетки (iPS химери) и 2 ° трансплантации. б ) генериране на Т-клетки в iPS химери на мащерка и при 2 ° трансплантации. Средната честота (%) ± sd на CD4 - CD8-, CD4 + CD8-, CD4 + CD8 + и CD4 - CD8 + сред всички CD3 + тимоцити, получени от тестваните клетки, е посочена в съответните порти. Клетките са предварително генерирани на единични, жизнеспособни -, CD3e +, CD45.1 +/CD45.2 + линии за млади контроли и клетки, получени от CD45.2 + iPS. Данните са от един експеримент (първични и вторични химери) за всяка iPS линия.
Изображение в пълен размер
Маса в пълен размер
За да се оцени потенциалът на хемопоетично репопулация на клетки, получени от iPS, ние допълнително трансплантирахме BM клетки от химерата на бластоциста/морула в смъртоносно облъчени гостоприемници (Фиг. 1, трансплантация 2 °). Поради сместа от получени от iPS и ендогенни в първичните химери, тези експерименти са конкурентни по своята същност. Това показа, че както количествено (получени от донори клетъчни нива), така и качествено (принос към всяка оценена линия) от всеки от получените от iPS HSC (iPS-HSC) са подобни на тези на ендогенните (млади) контролни HSC (Таблица 1). Тъй като родителските HSCs напълно липсват в Т-клетъчната линия (Фигури 2f и 3a), ние допълнихме нашите изследвания с по-подробен анализ на развитието на Т-клетки в iPS и 2 ° трансплантирани мащерки (Фигура 3). Това разкрива сравними честоти на CD3 + CD4 - CD8-, CD3 + CD4 + CD8 +, CD3 + CD4 + CD8- и CD3 + CD4 - CD8 + клетки с ендогенни (млади) контролни клетки (фиг. 3b) и се проверява за устойчиво ре - определяне на компетентността на Т-клетки от родителски донорски клетки, некомпетентни с Т-клетки.
Изображение в пълен размер
дискусия
Повечето органи съдържат популации от възрастни/соматични стволови клетки, които функционират, за да поддържат хомеостазата за цял живот. Предвид нарастващите доказателства, че възрастните стволови клетки не са пощадени от стареене, изглежда разумно, че големият спад в функциите на тъканите с възрастта се дължи на променената функция на свързаните с тях стволови клетки. В същото време всяка група стареещи стволови клетки трябва да се счита за потенциално хетерогенна; или защото отделните стволови клетки могат да бъдат предварително зададени по различен начин от младата възраст, различните преживявания, срещани от онтогенезата на отделното отделяне на стволови клетки, или комбинация от тези факти. Следователно, когато се изследват перспективите за обръщане на стареенето на клетките, е от решаващо значение да има функционален подход, за разлика от само хронологично старите клетки.
методи
Rosa26 rtTA мишки; Col1a1 4F2A (мишки 4F2A) беше любезно предоставен от Dr. Рудолф Яениш и са получени чрез лабораторията на Джаксън (склад номер 011004). Клетките от тези мишки експресират oct4, Klf4, Myc и Sox2 след добавяне на доксициклин 22. Всички мишки са с фон C57BL/6 и имат комбинация от вродени маркери CD45.1, CD45.2 или F1CD45.1 x CD45.2. Животните бяха настанени в съоръжения за животни в университета в Лунд и университета в Копенхаген. Всички експерименти с животни са извършени с одобрението на местните комисии по етика. За експериментите са използвани както мъжки, така и женски мишки.
Имунофенотипни анализи и сортиране на клетки
Изследване на клоналността на стареенето на HSC
Производство на iPS клетки
Генериране и характеризиране на клонинги на специфични химерни мишки
iPS химери. Избрани iPS клонинги (първоначално CD45.2 +) се инжектират в морула и бластоцисти от мишки CD45.1 + /.2 + в основно трансгенно мише съоръжение (Университет в Копенхаген, Дания). Получените химери се изследват за цвят на козината на покритието, чрез PCR срещу специфичен баркод и наличието на CD45.2 + положителни клетки в PB. На възраст 11-14 седмици химерни мишки бяха умъртвени и техните BM, PB и мащерка бяха събрани за анализ и сортиране чрез FACS.
2 ° трансплантация. За да се изследва конкурентоспособността на получените от iPS HSC, четири до пет смъртоносно облъчени (950 cGy) 8 до 14 седмични CD45.1 + или CD45.1 + /.2 + F1 мишки са трансплантирани с 2 х 106 нефракционирани BM клетки от всяка iPS химера. Разтварянето на много редове редовно се оценява от FACS PB.
За да изследваме молекулярното сходство на получените от iPS HSC с HSC от различна хронологична възраст, първо избрахме 3 силно експресирани HSC свързани гена, 3 референтни гена (Actb, Hprt и Gapdh) и 42 гена, диференцирано експресирани в HSCs поради възрастта. Втората категория е получена чрез анализ на публикувани преди това данни от микрочипове за HSC на стационарно състояние на млади и възрастни (шест полета на възраст). Данните бяха предварително обработени чрез извличане на стойности на изразяване на ниво на сондата, използвайки RMA 25 и допълнително анализирани с помощта на dChip 26 чрез филтриране на сонди с по-нисък израз от 50 във всички подмножества, за да се елиминират шумовете и с диференциален израз, по-малък от 1,5 пъти. На следващо място, регулираните нагоре и надолу гени бяха използвани като генни набори за анализ на обогатяване на генни набори.