елементи
абстрактно
Да се изследва механизмът на изчерпване на липидите от цинк-α2-гликопротеин (ZAG).
дизайн:
Изследванията са проведени при ob/ob мишки или върху изолирани адипоцити от тези животни или техните бедни колеги.
резултатите:
заключение:
Тези резултати предполагат, че ZAG не само предизвиква директна липолиза, но също така сенсибилизира мастната тъкан към други липолитични стимули.
Затлъстяването и последиците за здравето са основен проблем за западния свят и се смята, че са причинени както от генетични, така и от влияния на околната среда. Затлъстяването е свързано с инсулинова резистентност и диабет тип 2 чрез освобождаването на нестерифицирани мастни киселини и провъзпалителни цитокини от адипоцитите. Настоящият подход към управлението включва промяна в начина на живот, съчетан с фармакологична намеса, въпреки че възможностите за лечение са ограничени.
Доказано е, че ZAG предизвиква загуба на мастна тъкан чрез липолитичен ефект върху WAT, комбиниран с повишена експресия на отделящ протеин-1 в BAT, което би довело до увеличени енергийни разходи. 3, 15 Липолитичният ефект възниква от активирането на аденилил циклаза за образуване на цикличен АМР в процес, зависим от гуанозин трифосфат 4, който се отслабва от специфичния антагонист p3-AR SR59230A, 16, което предполага, че той се медиира от p3-AR. Използвайки ob/ob мишки като експериментален модел, това проучване оценява ефекта на ZAG върху липолитичните ензими и чувствителността на адипоцитите към липолитични стимули.
Материали и методи
материали
Затлъстели хипергликемични (ob/ob) мишки (73-77 g; Таблица 1) бяха настанени в собствената им колония. Произходът и характеристиките на тези животни са описани подробно по-рано. Експресията на ob гена на този фон води до по-тежка форма на диабет от мишките C/BL/6J ob/ob. Мишките бяха настанени в климатизирана стая при 22 ± 2 ° C и хранени ad libitum, плъхове и мишки от плъхове (Special Diet Services, Witham, Великобритания) и вода от чешмата. Мъжки мишки (на възраст от 20 до 21 седмици) са разделени на трима на клетка и им се прилага ZAG (35, 50 или 100 μg дневно) чрез интравенозно приложение (n = 6) или буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) (n = 6). Телесното тегло и приема на храна и вода, както и телесната температура, се проследяват ежедневно с помощта на ректален термометър (RS Components, Northants, UK) и измерването на глюкозата в урината също е измерено.
Маса в пълен размер
Определяне на телесния състав
Съставът на тялото се определя гравиметрично, както е описано по-горе. 3 Накратко, след завършване, животните се нагряват до 80-90 ° C, докато се достигне постоянно тегло и съдържанието на вода се определя от разликата между мокро и сухо тегло. Липидите се екстрахират от изсушения труп чрез екстракция с хлороформ/метанол (1: 1), етанол/ацетон (1: 1) и диетилов етер; разтворителите се обединяват и се изпаряват. Теглото на остатъка дава общата мазнина от кланичните трупове и теглото на обезмаслената маса от кланичните трупове се изчислява като разлика между първоначалното тегло на трупа и теглото на вода и мазнини.
Производство и пречистване на рекомбинантен човешки ZAG
Човешките клетки HEK 293F бяха трансфектирани с вектор за експресия на клетъчни бозайници pcDNA 3.1, съдържащ човешки ZAG, и избрани за растеж в неомицин (50 ug ml-1) в среда Freestyle в атмосфера от 5% CO 2 във въздуха при 37 ° C. Нива на протеин в хранителната среда постепенно се увеличава с времето до нивата на платото за приблизително 2 седмици след инокулацията. Клетките се отстраняват чрез центрофугиране при 700 g в продължение на 15 минути и средата (200 ml) се концентрира до обем от 1 ml стерилен PBS, използвайки 10 kDa Amicon Ultra-15 центробежен филтър (Millipore, Watford, Middlesex, UK). След това концентратът (съдържащ приблизително 2 mg протеин) се добавя към диетиламиноетилцелулоза (2 g), суспендирана в 20 ml 10 mM Tris, рН 8,8 и се разбърква при 4 ° С в продължение на 2 часа. ZAG се свързва с диетиламиноетилцелулозната целулоза, която се утаява чрез центрофугиране (1500 g за 15 минути) и се елуира чрез разбъркване в продължение на 30 минути при 4 ° С с 20 ml 10 mM Tris, рН 8,8, съдържащ 0,3 М NaCl. След утаяване, супернатантната течност, съдържаща ZAG, се концентрира до обем от 1 ml в стерилен PBS с помощта на центробежен филтър Amicon. ZAG не съдържа ендотоксин, както е определено от LAL Pyrogent единичен комплект за тестване (Lonza). Чистотата на рекомбинантния ZAG е> 95%, както е описано по-горе. 15
Приготвяне на човешки и миши адипоцити
Мастната тъкан се смила на малки фрагменти и се смила в бикарбонат на Krebs-Ringer, съдържащ 1 g 1-1 колагеназа и 4% говежди серумен албумин под 95% кислород/5% CO 2 при 37 ° C, както е описано. След 30 минути адипоцитите се филтрират през найлонова мрежа (размер на порите 250 μm), центрофугират се при 500 g за 2 минути и се измиват три пъти с PBS преди суспензия в среда RMPI 1640, съдържаща 10% фетален телешки серум и се поддържат в атмосферата . 5% CO 2 на въздух при 37 ° С. Културната среда се подменя ежедневно. Броят на адипоцитите се определя с хемоцитометър.
Липолитичен тест
За липолитични анализи 105 до 2 х 105 адипоцити бяха инкубирани с липолитичен агент в продължение на 2 часа в 1 ml бикарбонатен буфер на Krebs-Ringer, рН 7, 2 и степента на липолиза беше определена чрез измерване на освобождаването на глицерол, изразено като μmol глицерол на литър. 105 адипоцити за 2 часа. 19 Контролни проби, съдържащи само адипоцити, бяха анализирани за определяне на спонтанно освобождаване на глицерол.
In vivo липолиза чрез директно инжектиране на индикатора в мастни накладки
Western blot анализ
Прясно изрязаната WAT се промива в PBS и се лизира в реагент за екстракция на фосфозафе в продължение на 5 минути при стайна температура, последвано от обработка с ултразвук при 4 ° C. Проби от цитозолен протеин, генерирани чрез центрофугиране при 18 000 g за 5 минути при 4 ° C, се разделят на 12% SDS -полиакриламидна гел електрофореза при 180 V за около 1 час и прехвърлена в 0,45 μm нитроцелулозни мембрани, които са блокирани с 5%. Живейте в буфериран с Tris физиологичен разтвор, pH 7,5, при 4 ° C за една нощ. Както първичните, така и вторичните антитела се използват в разреждане 1: 1000. Инкубацията е в продължение на 1 час при стайна температура и развитието се засилва чрез хемилуминесценция. Петната са сканирани с денситометър, за да се определят количествено разликите.
Статистически анализ
Резултатите се отчитат като средно ± sem за поне три повторни експеримента. Различията в съставите между групите се определят чрез еднопосочен дисперсионен анализ, последван от множество тестове за сравнение на Tukey-Kramer. Стойности на P 23, което показва ролята на ERK пътя в неговата индукция. Подобни резултати бяха получени за експресията на ATGL протеин, която беше удвоена както от ZAG, така и от изопротеренол и това беше напълно отслабено от PD98059 (Фигура 1д), което отново показва ролята на ERK. Липолизата, индуцирана в изолирани ZAG адипоцити и в по-малка степен от изопротеренол, е отслабена от PD98059, въпреки че не се връща към базовите стойности (Фигура 1f). Тези резултати предполагат, че ERK пътят участва в повишената експресия на HSL и ATGL протеини в WAT. 24, 25 
Липолитична активност на ZAG в адипоцити, изолирани от постни и ob/ob мишки, човешки адипоцити и ефектът на ZAG върху експресията на HSL. а ) Индукция на липолиза в епидидимални адипоцити на мишки от постно (▪) и ob/ob ( □ ) мишки с изопротеренол или ZAG при посочените концентрации за 2 часа. Разликите от постните животни се отчитат като * P ** P *** P) в сравнение с базалните нива (▪). Разлики от епидидималните адипоцити в ( а ) се отчитат като ** P ** P *** P *** P † P †† P 15 Повишаването на телесното тегло се разглежда като увеличаване на мускулното тегло на гастрокнемиума, въпреки че няма ефект върху мускулното тегло на солеуса. НДНТ е почти удвоена (PBS 0,42 ± 0,12 g, ZAG 0,79 ± 0,66 g; нивата на глюкоза и инсулин P15 в плазмата са намалени, както и нивата на неестерифицирани мастни киселини и триглицериди, докато нивата на глицерол са намалени). подобно на това от 5 дни след прилагане на ZAG и отделянето на глюкоза с урината също е намалено (Фигура 2в), но основното намаление настъпва през първите 5 дни след приложението на ZAG, след което нивата остават постоянни.
Ефект на ZAG върху телесното тегло, температурата и екскрецията на глюкоза с урината при ob/ob мишки. а ) Ефект на ZAG (100 μg; интравенозно, ▪) или PBS (♦) върху телесното тегло на ob/ob мишки в продължение на 15 дни. Дните, когато ZAG не е прилаган, са отбелязани с ↑. ( б ) Ректална температура на ob/ob мишки, третирани с PBS (♦) или ZAG (▪), както е описано в ( а ). ( ° С ) Екскреция с урина на ob/ob мишки, прилагани с PBS (♦) или ZAG (▪) в продължение на 15 дни. Разликите от контролите на PBS се отчитат като * P
HSL експресия и липолитичен отговор на адипоцити от ob/ob мишки, прилагани ZAG. ( а ) Western blot показва експресия на ZAG в епидидимална (ep), подкожна (sc) и висцерална (vis) мастна тъкан на ob/ob мишки след 5 дни непрекъснато приложение на ZAG (35 μg; интравенозно на ден). Актинът служи за контрол на натоварването. ( б Адипоцитите (ep) бяха отстранени от мишки в края на 5 дни от лечението (ден 0) и се поддържаха в среда RPMI 1640, съдържаща 10% фетален телешки серум в отсъствие на ZAG за още 4 дни. Експресията на ZAG се определя чрез Western blot. ( ° С ) Western blot показва експресия на фосфо HSL в епидоцитите директно след отстраняване от мишки (ден 0) и след още 4 дни в тъканна култура в отсъствие на ZAG. ( д ) Липолитичен отговор на епидни адипоцити in vitro при ob/ob мишки, лекувани с PBS (▪) или ZAG (in vitro).
Експресия на HSL, ATGL и фосфо ERK протеини в WAT ob/ob мишки, третирани със ZAG. Уестърн петна, показващи експресия на HSL ( а ), ATGL ( б ) и фосфо ERK ( ° С ) при епидидимални (еп), подкожни (sc) и висцерални (vis) адипоцити, отстранени от ob/ob мишки, третирани или с PBS, или със ZAG (35). интравенозно) в продължение на 5 дни. Денситометричният анализ представлява средното за три отделни петна. Разликите от третираните с PBS животни се отчитат като * P
Скоростта на загуба на радиоактивност от епидидима ( а ) [U-14C] белязан с палмитат епидидимал, ( б ) подкожно, ° С ) мезентериални (висцерални) мастни подложки на ob/ob мишки след третиране с ZAG (50 μg; интравенозно); iv) всеки ден) (▪) или PBS (♦) в продължение на 5 дни. ( д ) натрупване на [U-14C] палмитат в различни органи 1 час след директно инжектиране в епидидималните мастни възглавнички на ob/ob мишки след приложение на ZAG (50 μg; iv на ден) ( □ ) или PBS (▪). Разликите от контролите на PBS се отчитат като * P ** P 14 C] палмитик от епидидимални мастни натрупвания също би корелирал с повишен липолитичен отговор на ZAG (Фигура 1а) в сравнение с подкожните и висцералните адипоцити (Фигура 1b). Този ефект се наблюдава и при β3-AR агониста, BRL 37344 (Фигура 6а), който причинява повишена стимулация на липолизата в епидидимални адипоцити от животни, лекувани с ZAG, докато при подкожни и висцерални адипоцити, предварителната обработка със ZAG не е оказала ефект върху липолитичните отговор. Тези резултати предполагат, че ZAG може да действа синергично с β3-AR агонисти за мобилизиране на липиди. Сенсибилизация на адипоцитите до BRL 37344 се наблюдава и в краткосрочна култура след 2 часа инкубация със ZAG, но не и изопротеренол (Фигура 6b).
Първоначално се смяташе, че HSL е ензим, ограничаващ скоростта, но последните данни 35 предполагат, че ATGL може да бъде ограничаващ фактор. Подобно на HSL, 13 нива на ATGL в подкожната мастна тъкан на затлъстели индивиди са показали намаление, въпреки увеличаването на експресията на иРНК, 36 въпреки че други проучвания 37, 38 съобщават за намаляване както на HSL, така и на ATGL иРНК и протеин. Съществува значителна корелация между експресията на ATGL и HSL иРНК както във висцералната, така и в подкожната мастна тъкан, което предполага общ регулаторен механизъм за тяхната експресия. 37, 38 Това може да е свързано с активирането на ERK пътя, както се съобщава при in vitro проучвания, тъй като ERK се активира във всички депа на мастната тъкан след прилагане на ZAG на ob/ob мишки. Доказано е, че както инсулиновата резистентност, така и хиперинсулинемията при индивиди със затлъстяване корелират с експресията на ATGL и HSL протеин, независимо от мастната маса. По този начин способността на ZAG да повишава експресията както на HSL, така и на ATGL би корелирала със способността му да облекчава инсулиновата резистентност15, въпреки че други механизми, като повишено усвояване и окисление на глюкоза и мастни киселини, вероятно са по-важни.
Лечението на ob/ob ZAG мишки също повишава експресията на ZAG протеин в епидидимална, подкожна и висцерална мастна тъкан. Въпреки че експресията на ZAG е с ниско затлъстяване, 7, 8, 9, беше показано, че експресията му в WAT е увеличена 10 пъти при мишки с кахексия. Доказано е, че това се дължи на повишаване на серумния кортизол 39, въпреки че е доказано, че некротизиращият фактор на туморния некротизиращ фактор α води до 4-кратно намаляване на експресията на ZAG при синдрома на Симпсън-Голаби-Бемел при 40 човешки адипоцити, осигурявайки потенциален механизъм за обяснение на ниски нива. ZAG, открит в мастната тъкан на затлъстели лица. Индукцията на ZAG в 3T3-L1 адипоцити чрез прилагане на екзогенен ZAG е доказано, че е отслабена от селективния β3-AR антагонист SR59230A, което предполага, че е медиирано от β3-AR. 39
ZAG може да е необходим за оптимален p3-AR ефект, тъй като нокаутиращите мишки ZAG показват по-нисък отговор на специфичния β3-AR агонист CL316243. Тъй като нивата на ZAG са ниски при затлъстяване, експресията на 7, 8, 9, p3-AR също може да е неоптимална. По този начин, p3-AR агонистите може да изискват оптимална ZAG активност, както се доказва от засиления липолитичен ефект на изопреналин и BRL 37344 в адипоцити от ob/ob мишки, лекувани със ZAG. В допълнение, много от ефектите на ZAG при диабет в този модел 15 вероятно са свързани с неговата 3-AR агонистична активност. 16p3-AR агонистите индуцират липолиза в WAT, чрез класическия цикличен AMP и протеин киназен път A, и чрез ERK пътя, който представлява 15-25% от общата липолиза. 32
Адипоцитите от затлъстели мишки също експресират 2 пъти по-ниски нива на гама, стимулираща субединица на гуанозин трифосфат свързващия протеин, който стимулира аденилил циклазата. Доказано е, че ZAG увеличава експресията на Gαs и намалява експресията на инхибиторния G-протеин, Gαi, в 3T3 адипоцити, 43 което предполага механизъм, чрез който ZAG може да усили липолитичния отговор в допълнение към индуцирането на HSL и ATGL.
Тези резултати показват, че ZAG причинява значително намаляване на мастната маса при ob/ob мишки. Ефектът се проявява чрез липолитична активност заедно с индуцирането на експресия на HSL и ATGL протеин в адипоцитите, което би предизвикало сенсибилизация към други липолитични стимули. В допълнение, освободените липиди ще бъдат превърнати в топлина чрез повишено тегло на НДНТ. Тези резултати предполагат, че ZAG може да преодолее някои от метаболитните промени, свързани със състоянието на затлъстяване. По-нататъшни проучвания ще изследват ролята на β-адренергичните рецептори в действието на ZAG.