елементи
абстрактно
Характерно е, че клетките на рак на простатата (PCa) показват значително намаляване на вътреклетъчния цинк; Отговорният механизъм обаче не е ясно разбран. HOXB13 участва в прогресията на PCa и е свръхекспресиран в устойчива на кастрация PCa. ДНК анализът на LNCaP Pca клетъчни микрочипове показа, че ZnT цинковите изходни транспортери са забележимо регулирани сред андроген-независими HOXB13 целеви гени. В допълнение, екзогенният HOXB13 причинява намаляване на вътреклетъчните концентрации на цинк в PCa клетки, стимулира NF-κB-медиирана сигнализация чрез намаляване на NF-κB алфа инхибитора (IκBα) и подобрява RelA/p65 ядрената транслокация. Човешките тумори на простатата също показват силна обратна корелация между експресията на HOXB13 и IκBa протеин. Следователно, HOXB13 стимулира PCa клетъчна инвазия, която се инхибира от потискането на ZnT4. В допълнение, проучвания в PC3 ортотопичен модел на мишка на PCa метастази показват, че HOXB13 е мощен метастатичен стимулатор. Взети заедно, тези резултати показват, че HOXB13 насърчава PCa инвазия и метастази чрез намаляване на вътреклетъчните нива на цинк, като по този начин стимулира NF-κB сигнали, и предполагат, че HOXB13 действа като модулатор на вътреклетъчните нива на цинк, който насърчава злокачествените свойства на PCa.
В това проучване разгледахме ролята на HOXB13 в цинково-медиираната регулация на NF-κB сигнализиране, за да подобрим нашето разбиране за участието на HOXB13 в прогресията на PCa към CRPC. Нормалната човешка простата натрупва по-високи нива на цинк от която и да е друга мека тъкан и следователно цинкът се счита за основен компонент на здравата простата. Въпреки това, нивата на цинк са значително намалени в туморите на простатния епител и продължават да намаляват по време на прогресията към андроген-независим растеж. В това проучване ние извършихме допълнителен анализ на ДНК микрочипове в LNCaP клетки, отгледани в условия, изчерпани с андроген, за да профилираме андроген-независими гени, насочени към HOXB13. Един от тези целеви гени, изходният носител на цинк ZnT4, беше анализиран подробно, за да се идентифицира всякаква връзка между HOXB13 и цинково-медиирани каскади от биомолекули. Това проучване е проведено, за да се определи как клетките на простатата се адаптират към оцеляването чрез туморогенеза и прогресия до CRPC клетки.
резултатът
ZnT4 (транспортьор на изходен цинк) е целта на HOXB13
ZnT4, цинков изходен транспортер, е целта на HOXB13. ( а ) Йерархичен клъстер анализ на гени, диференцирано експресирани в LNCaP клетки при условия, изчерпани от хормони. За изследване на целевите гени HOXB13 е извършен анализ на ДНК микрочипове във физиологично състояние, при което HOXB13 (B1-B3) е минимално свръхекспресиран в LNCaP в сравнение с контролите (G1G3). Това изображение показва надрегулирани и понижени преписи в червено и зелено. Този преглед на относителните нива на експресия на HOXB13-регулирани гени показва целеви гени, чиято експресия се е променила най-малко два пъти средното количество в контролата. ( б ) Експресия на иРНК транспортер на цинк в LNCaP клетки (горен панел). Експресията на HOXB13 се контролира от аденовирус. Показаната генна експресия е средство за три независими RT-PCR анализа в реално време и се представя като средно ± sd (долен панел). ( ° С ) Експресия на ZnT4 протеин с помощта на Western blot. Клетките HEK293 бяха трансфектирани с хомоамин, изтрит от pFLAG-HOXB13, pFLAG или pFLAG-HOXB13.
Изображение в пълен размер
HOXB13 намалява вътреклетъчните нива на цинк и стимулира NF-κB сигнализиране в PCa клетки
HOXB13 намалява вътреклетъчните нива на цинк и стимулира NF-κB сигнализиране в PCa клетки. Клетките на LNCaP-S4 се отглеждат в условия, изчерпани с андроген в продължение на 3 дни и по този начин се принуждават да експресират HOXB13. LNCaP-shHOXB13 са потиснати от HOXB13 клетки. PC3 клетките бяха трансфектирани с Flag-HOXB13. LNCaP-S4 клетки ( а ) или контролни клетки Tet-on ( б ) са лекувани с Dox за индуциране на HOXB13. Потиснати HOXB13 клетки (1-3, 4-1) също бяха използвани и сравнени със смесени клетки ( ° С ). Клетките се анализират за вътреклетъчно съдържание на цинк. След култивиране на PC3 клетки ( д ) или клетки LNCaP-S4 ( д ) TNF-α беше добавен за 24 часа, за да стимулира NF-кВ активността. LNCaP-S4 клетки ( е ) или shHOXB13-LNCaP ( ж ) бяха предварително инкубирани с цинк и/или пиритион за 30 минути и след това инкубирани с TNF-a за 2 часа. Клетките бяха оценени чрез анализи с луцифераза. *** в диаграмата показват значителни разлики между двете групи, определени от двустранен t-тест на Student (P
Активирането на NF-κB от HOXB13 се медиира от IκB. ( а ) Експресията на HOXB13 беше индуцирана в LNCaP-S4 клетки с Dox и съответните лизати бяха събрани и уестърн блотирани (ляв панел, цели лизати; десен панел, ядрени екстракти). ( б ) Клетките, потиснати с HOXB13 (1-3 и 4-1) и смесените контролни клетки бяха оценени за експресия на pNF-кВ протеин (ляв панел, цял лизат, десен панел, ядрени екстракти).
Изображение в пълен размер
Експресията на HOXB13 индиректно корелира с експресията на IκBα при тумори на простатата
Тъй като HOXB13 регулира NF-кВ активността чрез намаляване на активността на IκBα в PCa клетки, ние оценихме експресията на тъкани на HOXB13 и IκBα в 9 CRPC и 12 андроген-зависими PCases (ADPC). Тъй като обаче PCa е хетерогенен, ние оценяваме само PCa клетки с положителен ефект върху андрогенния рецептор (AR). Фигура 5А показва експресията на HOXB13 и IκBα и че туморите свръхекспресиращи HOXB13 не експресират IκBα (a-d). Това важи особено за CRPCs, тъй като само свръхекспресиращи CRPC HOXB13 не изразяват IκBα. Няколко HOXB13 свръхекспресиращи ADPCs експресират IκBα (e-h), докато някои туморни клетки и клетки от доброкачествена простатна хиперплазия показват ниска експресия на HOXB13 и висока IκBα (i-1). Когато на високите и ниските членове произволно се присвои резултат 2-3 или 0-1, термините HOXB13 и IκBα бяха обратно корелирани (χ 2 = 4, 888, P
Експресията на HOXB13 корелира индиректно с IκBα при тумори на простатата. ( A ) Имунооцветяването се извършва в различни тъкани на простатата, като се използват серийни секции. AR беше използван като вътрешен контрол. Скалата е 100 μm. Вложките бяха показани с увеличение x 40. ( Б. ) Стълбовидна диаграма, показваща HOXB13 резултати от HOXB13 свръхекспресирани и -експресирани PCas. Експресиите на HOXB13 и IκBa в тумори бяха оценени (0, отсъстващи, 1, слаби, 2, умерени и 3 силни). Звездичките показват P
HOXB13 увеличава инвазивния потенциал на PCa клетките. ( а ) Клетъчната инвазия беше измерена с помощта на матригел трансуел. Потиснати HOXB13 клетки (1-3 и 4-1) и смесени клетки се отглеждат в условия, изчерпани с андроген в продължение на 2 дни. В долните камери се добавя среда, съдържаща фибронектин. След 24 часа клетките бяха оцветени и изображенията бяха заснети. ( б ) Клетките бяха преброени в произволно избрани пет полета при увеличение х 200; резултатите са представени като стълбовидна диаграма. ( ° С Докс-индуцираните HOXB13 S4 клетки се посяват и след това се трансфектират с si-ZnT4 (50 пМ) или si-контролни и трансфектирани клетки се прилагат към анализи за инвазия, както е описано по-горе. Тестовете са извършени в три екземпляра; колоните представляват средните стойности ± sd ( д ) shHOXB13-LNCaP клетки се отглеждат в условия, изчерпани с андроген в продължение на 2 дни. След това клетките се екстрахират и лизатите се оценяват чрез Western blot. ( д ) Кондиционирана среда от LNCaP-shHOXB13 клетки (ляв панел) или LNCaP-S4 (десен панел) беше подложена на анализ на желатинова зимография. Показани са формите на MMP-9 и MMP-2.
Изображение в пълен размер
HOXB13 стимулира метастази в клетъчни лимфни възли на PCa
Метастази на PC3-HOXB13 тумори в пара-аортни лимфни възли. ( A ) Стабилно трансфектираните PC3 клетки бяха имуноблотирани за FLAG. ( Б. ) Параорталните лимфни възли бяха разделени, за да се открият метастази и бяха преброени броя на метастазите. Честотата на метастази в миши лимфни възли е 75,0% (шест от осем мишки, носещи тумор) в групата PC3-HOXB13 и 14,3% (една от седемте мишки, носещи тумор) в групата PC3-имитация. ( ° С ) Показани са избрани локални (a - c) и метастатични (d - f) PC3-HOXB13 тумори. Полетата в 'a' и 'd' са уголемени в 'b' и 'e'. Серийните секции „b“ и „e“ бяха имуномаркирани за FLAG (c, f).
Изображение в пълен размер
дискусия
Нашите резултати показват, че HOXB13 в крайна сметка стимулира инвазивните свойства на PCa клетките чрез намаляване на вътреклетъчните нива на цинк, особено при андрогенно изчерпани условия. Ние предлагаме хипотетичен модел за механизма на действие на HOXB13 по време на PCa инвазия (Фигура 8): (1) HOXB13 усилва регулирането на каналите за изтичане на цинк, включително ZnT4, в условия, изчерпани с андроген. (2) ZnT4 улеснява изтичането на цинк от клетките. (3) Намалените нива на вътреклетъчния цинк стимулират експресията на IKKα, което допълнително фосфорилира и разгражда IκBα. (4) Освободеният стимулиращ NF-кВ, като p65 и p50, се транслоцира в ядрото и активира експресията на гени, участващи в инвазията на туморни клетки и метастази.
Хипотетичен модел на HOXB13-медиирана PCa инвазия. Когато HOXB13 е свръхекспресиран при резистентни на аблация рак на простатата, ние предлагаме, че HOXB13 функционира, за да насърчи инвазията на ракови клетки, както следва: (1) HOXB13 усилва регулирането на каналите за изтичане на цинк, включително Znt4, в условия на изчерпване на андрогена. (2) ZnT4 улеснява вътреклетъчния изтичане на цинк. (3) Намалените вътреклетъчни нива на цинк стимулират експресията на IKKα, който фосфорилира и разгражда IκBα. (4) Освободеният стимулиращ NF-кВ, включително p65 и p50, се транслоцира в ядрото и активира експресията на гени, участващи в инвазията на туморни клетки.