елементи

абстрактно

Trio Rho Guanine Nucleotide Exchange Factor (RhoGEF) Триото насърчава актинизационната полимеризация чрез директно активиране на малката GTPase Rac1. Последните проучвания показват, че поведенчески фенотипове, свързани с нарушения на аутистичния спектър (ASD) при животински модели на ASD, могат да се получат чрез нарушаване на регулирането на Rac1 контрола на полимеризацията на актина в глутаматергичните синапси. При хората открихме голяма група от мутации, свързани с ново ASD, в активиращия Trio домейн на Rac1, GEF1. Нашето проучване показва, че тези мутации произвеждат или хипофункционални, или хиперфункционални форми на Trio в неврони на гризачи in vitro. В съответствие с патологичното увеличаване или намаляване на глутаматергичната невротрансмисия, наблюдавано при животински модели на ASD, откриваме, че тези мутации водят или до намаляване на експресията на синаптичен AMPA рецептор, или до повишена глутаматергична синаптогенеза. Заедно нашите открития предполагат както прекомерна, така и намалена активност на Trio и произтичащата от това синаптична дисфункция в свързана с ASD патогенеза и сочат пътя на Trio-Rac1 в глутаматергичните синапси като възможна ключова точка на сближаване на много гени, свързани с ASD.

Наскоро установихме, че протеинът Trio на гуаниновия нуклеотиден обменен фактор (RhoGEF), заедно с неговия паралог Калирин, е необходим за глутаматергична невротрансмисия 9. Експресията на трио в мозъка е най-висока в края на пренаталното/ранното постнатално развитие, докато експресията на Kalirin не достига пик до юношеството 10, 11, 12. Множество изоформи на Trio, получени от един ген, се експресират в мозъка 13. Например Trio-9 е преобладаващата изоформа, експресирана в кората и хипокампуса. Както триото, така и Калирин се намират в постсинаптичния отдел на глутаматергичните синапси, наричани дендритни въртения 10, 14. В завъртанията тези два протеина регулират функцията на глутаматергичен синапс чрез способността на техните GEF1 домейни да насърчават Rac1-зависима актинична полимеризация 9, 15, 16. Освен това открихме, че Trio и Kalirin са цели на фосфорилиране на CaMKII, които са необходими за индуцирането на дългосрочно усилване (LTP) 9, клетъчен процес, за който се смята, че е в основата на обучението и паметта. По този начин тези протеини играят решаваща роля в регулирането на глутаматергичния синапс.

Тук идентифицираме голяма група от мутации, свързани с de novo ASD, в активиращия Rac1 домейн на Trio, GEF1. Степента на мутационно групиране, открита в домена Trio GEF1, и изчислително прогнозираният ефект от тези мутации, свързани с ново ASD, върху взаимодействията с Trio-Rac1 предполагат силна връзка на дисрегулацията на пътя на Trio-Rac1 при свързани с ASD патологии. Систематичното изследване на тези мутации в Trio-9 разкрива както хипоморфни, така и хиперморфни мутации, които драматично и двупосочно засягат функцията на Trio и ефекта на Trio върху глутаматергичната невротрансмисия в хипокампалните пирамидални неврони CA1. Животинските модели на ASD показват патологично увеличение и намаляване на глутаматергичната невротрансмисия 17, 18, 19. Нашето проучване разкри ASD-свързани миссенс мутации в единичен синаптичен Rac1-активиращ протеин, който може да доведе до двупосочни промени в глутаматергичната невротрансмисия, като по този начин предполага както намалена, така и прекомерна активност на Trio и в резултат синаптична дисфункция при свързани с ASD заболявания.

резултатът

Мутации, свързани с ASD в триото

novo

De novo мутации, свързани с ASD в триото. Мисенс мутации, б глупости a ° С номер на копие в Трио при лица със заболявания, свързани с ASD. Отчитат се различни протеинови домейни, започващи от N-края: Sec14 домейн, повторения на спектъра, GEF1 домейн (съставен от Dbl хомологичен домейн (DH1) и плекстринов хомологичен домейн (PH1)), 3c Src хомологичен домейн (SH3) и GEF2 домейн ( съставен от Dbl хомологичен домейн (DH2) и Pleckstrin хомологичен домейн (PH2)). За всяка мутация се предоставя индивидуална диагноза, заедно с информация за промяната на аминокиселинната последователност Trio. Местоположение на аминокиселинни мутации от NP_009049.2

Изображение в пълен размер

Според неотдавнашен анализ на консорциума за агрегиране на Exome (ExAC), базиран на 60 706 напълно секвенирани човешки генома, TRIO е един от 60-те най-ограничени човешки гени, което предполага висока функционална значимост. Триото има изключително нисък брой мисенс мутации (z = 6, 29) и загуба на функция (LoF) на безсмислени мутации (pLi = 1), като същевременно има среден процент на синонимни мутации (z = 0, 19) 27 . Ограничението в GEF1/DH1 домейна е още по-силно изразено. Забележително е, че не открихме никакви миссенс или загуба на функционални мутации (LoF) в GEF1/DH1 домейна в 9 937 контролни генома 24 (Таблица 1 и Фиг. 2а), което показва силно обогатяване на мутации, свързани с ASD в този регион (Фиг. 1). 2б). Също така не открихме липсващи мутации в домейна GEF1/DH1 в базата данни 1000 Genomes 28 (Допълнителна фигура 1а). Важното е, че в този регион присъстват синонимни мутации, изброени в базата данни 1000 генома (Допълнителна фигура 1б). Взети заедно, тези данни показват силно обогатяване на de novo свързани с ASD мутации в GEF1/DH1 Trio регион.

Маса в пълен размер

Три мутации, открити в контролни и свързани с ASD геноми. Мутации на Trio-9, открити в контролни геноми (от De Rubeis et al., 2014 24). б Графиката показва броя на мутациите, свързани с ASD (червени ленти) и контролите (черни ленти), намерени във всеки Trio-9 домейн при лица със свързани с ASD разстройства и контроли без свързани с ASD разстройства. Обогатяването на свързаната с ASD мутация на Trio във всеки Trio домейн се изчислява чрез изваждане на броя на контролните мутации от броя на de novo свързани с ASD мутации, наблюдавани във всеки домейн. Прозрачните триъгълници представляват присъствието (червено), отсъствието (черно) и степента на обогатяване на ASD, свързано с мутация във всеки домейн.

Изображение в пълен размер

За да се оцени значимостта на мутациите на Trio протеин и Trio-GEF1/DH1 при нарушения, свързани с ASD, сравнихме очаквания брой de novo мутации с наблюдаваните мутации. Използвахме мутационен модел, разработен от Samocha et al. 29. Резултатите от Samocha et al. Те се основават на 1078 случая на ASD и 151 случая на психични увреждания и това проучване успя да идентифицира SCN2A и SYNGAP като значими при свързани с ASD заболявания. В това проучване наблюдавахме много по-голям брой случаи (4890 при свързани с ASD разстройства) и голям брой мутации, липсващи в TRIO (11 случая на ASD в сравнение с 1,07 случая, очаквани за същия брой индивиди в общата популация) . значително подобри статистиката, което доведе до силно значима връзка на TRIO с целия синдром с ASD-подобни синдроми (стойност P -8; Допълнителна таблица 3). Открихме още по-силна връзка със свързаните с ASD синдроми за поддомейн RF1/DH1, взаимодействащ с Rac1 (7 случая в сравнение с очакваната 0, 06, P-стойност от 13; Допълнителна таблица 3).

Смята се, че ASD мутациите в Trio променят активирането на Rac1

Прогнозирани ефекти от свързани с ASD мутации DH1 върху активирането на Rac1. GEF1 домейнът в контекста на целия протеин е показан по-горе с GEF1 домейн, идентифициран с пунктиран червен квадрат. Преглед на структурата на комплекса Trio-GEF1 и Rac1 е даден по-долу, като двата взаимодействащи протеина са показани като сини и оранжеви карикатури (протеинов код 2NZ8). Остатъците от аминокиселини, мутирали при заболявания, свързани с ASD, са показани като мъниста с пурпурни въглеродни атоми. Смесените вложки представляват взаимодействия между аминокиселинните остатъци в дивия тип и мутантния протеин. Остатъците от див тип са етикетирани и представени във вид на пръчка, като въглеродните атоми са оцветени в лилаво. Мутиралите аминокиселини са показани със зелени или жълти въглеродни атоми. Водородните връзки/солевите мостове са показани с пунктирани линии. Водните молекули, участващи във взаимодействията на GEF1-Rac1, са обозначени с прозрачни червени мъниста

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Експресията на Trio-9 I1329HLAL * инхибира синаптичната функция

Изображение в пълен размер

40% намаление на амплитудата на AMPAR-eEPSC (фиг. 4h, j). Експресията на Trio-9 I1329HLAL * няма ефект върху амплитудата на NMDAR-eEPSC (Фиг. 4i, k). Този фенотип беше забележително подобен на фенотипа, наблюдаван при Trio shRNA. Ефективността на двойка импулси (PPF) също е непроменена от постсинаптичната експресия на Trio-9 I1329HLAL *, което показва, че експресията на този мутант не повлиява освобождаването на пресинаптичен глутамат (Фиг. 41).

Експресията на Trio-9 K1431M инхибира синаптичната функция

След това изследвахме мутацията на Trio missense, Trio-9 K1431M. Лице с тази мутация показва тежки аутистични симптоми и умствена изостаналост. Трябва да се отбележи, че предишно проучване, използващо мутации при сканиране на аланин за идентифициране на важни остатъци в GEF1 Trio региона, идентифицира този остатък заедно с R1428 като критичен за активиране на Rac1. Нашето моделиране на мутацията K1431M прогнозира нарушаване на редица взаимодействия, медиирани от водород и вода, което води до намален афинитет между домейните Trio GEF1/DH1 и Rac1 (Фиг. 3 и Таблица 2). FLIM анализът показа, че Trio-9 K1431M, подобно на Trio-9 I1329HLAL *, значително намалява способността на Trio-9 да активира Rac1 биосензора в клетки HEK293 (фиг. 5b). Както беше предсказано, тази мутация беше силно намалена чрез активиране на Rac1. След това експресирахме Trio-9 K1431M в пирамидални неврони CA1 и установихме, че Trio-9 K1431M фенокопичен Trio-9 I1329HLAL *. Trio-9 K1431M причинено

50% намаление на амплитудата на AMPAR-eEPSC (фиг. 5в), което също е вероятно поради увеличаване на тихите синапси, тъй като е имало намаляване на квантовото съдържание без промяна в амплитудата на NMDAR-eEPSC или промяна в PPF (фиг. 5d-f). Както при дивия тип Trio-9, промяната в амплитудите на NMDAR-eEPSC в експресиращите Trio-9 K1431M неврони се дължи на колебанията на квантовото съдържание (Допълнителна фигура 4в). Взети заедно, тези данни показват, че Trio-9 K1431M, подобно на Trio-9 I1329HLAL *, има вероятност да се конкурира с ендогенния Trio от див тип в синапсите и да доведе до намаляване на синаптичната функция на AMPAR. Освен това установихме, че мутацията на миссенс в домейна Trio GEF1, която е идентифицирана при индивид без ASD (Trio-9 S1575N) 28, няма ефект върху способността на Trio-9 да увеличава амплитудата на AMPAR-eEPSC в пирамидата CA1 неврони (допълнителна фигура 1а). а 5).

Изображение в пълен размер

Експресията на Trio-9 P1461T инхибира синаптичната функция

Изображение в пълен размер

Trio-9 D1368V води до хиперфункция Trio

Специфичната връзка на мутациите на Trio с ASD се подкрепя от анализ на нейния близък паралог, Kalirin, който има уникален профил на експресия на развитието. Не са наблюдавани мисенс мутации, свързани с ASD, при Kalirin, въпреки че те играят подобна роля в регулирането на глутаматергичния синапс 9. Триото е силно изразено в ранното постнатално развитие и намалява с възрастта 10 години. За разлика от това, експресията на Калирин достига своя връх едва в юношеска възраст 11, 12. По-специално, калириновата функция е свързана с по-късни невропсихиатрични разстройства като шизофрения и болест на Алцхаймер 38, 39, 40, 41. Мутация в GEF1/DH1 домейна на Kalirin, която инхибира активирането на Rac1, също е установена при индивид с шизофрения. По този начин, експресионните профили на Trio и Kalirin изглежда съвпадат с възрастта на поява на заболяванията, в които са замесени, което предполага, че Rac1-медиирано нарушаване на синаптичната регулация в различни моменти от времето в развитието на мозъка води до различни заболявания, свързани с мозъка .,

Наскоро бе установено, че нарушенията в синаптичната Rac1-медиирана регулация на актини лежат в основата на развитието на поведенчески фенотипи, свързани с ASD, в добре установени животински модели на свързани с ASD заболявания 5, 6, 7. Неотдавнашно проучване също идентифицира Rac1 като вероятна точка на сближаване на редица рискови гени за ASD 8. Тук идентифицираме домена за активиране на Rac1 на регулаторния протеин на синаптичния актин, Trio, като гореща точка за свързани с ASD мутации de novo. Тъй като се смята, че нарушаването на регулацията на глутаматергичната невротрансмисия лежи в основата на поведенческите фенотипи в много животински модели на ASD и тъй като не е установено, че протеините след активността на Trio съдържат значителни мутации, свързани с ASD, е изкушаващо да се предположи, че променената функция на Trio представлява основна точка на сближаването на редица фактори, които пораждат ASD. Занапред ще бъде необходимо да се определи разпространението на променената функция на Trio при лица с ASD и да се установи дали терапиите, свързани с Trio, могат да се прилагат за обръщане на свързани с ASD поведенчески фенотипове при значителен брой лица с това заболяване.

методи

Моделиране на мутации

Ефектът на мутациите върху стабилността и свързването се прогнозира, използвайки кристалната структура с висока разделителна способност на Trio GEF1 комплекс с Rac1 (PDB код 2NZ8). Изчисленията бяха извършени с помощта на софтуер за молекулярно моделиране на ICM (Molsoft LLC). Енергийната оптимизация на конформацията на мутантния протеин беше извършена с помощта на пристрастен вероятностен алгоритъм Монте Карло. След това промяната на свободната енергия в стабилността на протеините ∆∆ G стабилност (1) и свързването с протеини ∆∆ G свързването (2) беше изчислена като разлика в сгъването или свързването на свободните енергии на мутантния и див протеин:

Мутациите или с bG свързване> 2, или с ∆∆G стабилност> 2 бяха предвидени като разрушителни за Trio активиране на Rac1.

Експериментални конструкции

Човешкото Trio-9 (или Trio-9s в справка 13) е генерирано от Trio-FL cDNA, щедро предоставена от Dr. Бети А. Айпър (Университет на Кънектикът). Свързаните с ASD мутации на Trio са направени от Trio-9 cDNA, като се използва PCR с припокриване-удължаване, последвано от In-fusion клониране (Clontech). Всички плазмиди бяха потвърдени чрез ДНК секвениране. КДНК на Trio-9 бяха клонирани във pCAGGs вектор, съдържащ IRES-mCherry. Вектор pFUGW, експресиращ само GFP, се експресира съвместно с pCAGG-IRES-mCherry конструкции за подобряване на идентифицирането на трансфектирани неврони и се използва като контролен вектор за изобразяване на гръбначния стълб. Конструкцията на биосензор Rac1 е в рамките на pTriEx-HisMyc гръбнак, както е описано по-рано в реф. 30 и беше предоставен щедро от д-р Яап Д. ван Буул (Sanquin).

HEK293 клетъчна трансфекция

Клетките HEK293T (ATCC) се култивират в DMEM с 10% FBS в 37 ° С инкубатор, снабден с 5% CO 2. Клетките се поставят върху 35 mm стъклени дънни плочи, покрити с Matrigel. Клетките се отглеждат до 50% сливане, преди да бъдат трансфектирани с експресионните конструкции Trio-9 заедно с биосензора Rac1, използвайки реагент за трансфекция FuGENE HD. Използвано е съотношение на биосензорна ДНК Trio-9/Rac1 от 1: 1. Покритите клетки се инкубират в трансфекционната смес в продължение на 16 часа и след това се заменят с прясна среда. Проведени са експерименти с HEK293

20 часа след трансфекцията.

Флуоресцентно изображение през целия живот (FLIM)

$$ E = 1 - \ tau DA> \ tau D $$

Фазорът на FRET биосензора в отсъствие на активатора се получава от независим препарат. Фазорът, съответстващ на потушения донор, се изчислява съгласно уравнението за охлаждане (3). Позициите на всички възможни фазори, които се гасят с различна ефективност, описват извита траектория във фазовия график. Експерименталната позиция на фазора на даден пиксел по траекторията определи количеството на охлаждане и следователно FRET ефективността. Приносът на фона и на донора без акцептор се оценява, като се използва правилото на линейната комбинация 49, 52, като фоновият фазор и донорът неугасени се определят независимо. Всички фазови трансформации и анализът на данните от FLIM данни бяха извършени с помощта на софтуера SimFCS (Калифорнийски университет, Ървайн).

електрофизиология

Анализ на плътността на гръбначния стълб

За анализ на плътността на гръбначния стълб, контролни и експериментални CA1 пирамидални неврони в органотипични култури на хипокампални резени, направени от P6 кученца плъхове, са биологично трансфектирани с FUGW-GFP и pCAGGS-IRES-mCherry конструкции приблизително 18–20 h след посяването. Изображенията са получени на DIV 7, като се използва микроскопия със супер разделителна способност (Elyra Microscope System, Zeiss). За използване с наличния обърнат микроскоп и обектив с обектив за потапяне в масло, резените бяха фиксирани в 4% PFA/4% захароза в PBS и измити 3 пъти с PBS. За усилване на GFP сигнала, резените след това бяха блокирани и проникнати в 3% BSA в PBS, съдържащ 0,1% Triton-X и оцветени с първично антитяло срещу GFP (2 μg/ml, Life Technologies A-11122), последвано от измивания в PBSTx и оцветяване с конюгирана с Alexa 488 вторична (4 μg/ml, Life Technologies A-11034). Филийките бяха допълнително обработени със съкратен протокол 55, базиран на SeeDB, в опит да се намали сферичната аберация. След това резените бяха монтирани в SlowFade Gold (Life Technologies) за изображения. Z-стековете са направени от 30 µm участъци от вторични апикални дендрити

30 fromm от сомата. Изображенията са получени със 100 × маслена цел (100 ×/1,46) в режим SIM с помощта на предоставена 42 μm SIM решетка и са обработени и реконструирани с помощта на доставения софтуер (Zen, Zeiss). Експериментатор, заслепен за състоянието на изображението, извърши анализ на изображението на отделни секции, използвайки ImageJ за преброяване на бодли, простиращи се странично от дендрита.

Статистически анализ

За статистиката на мутациите, свързана с ASD в Trio, използвахме прост тест на Поасон, подобен на този, използван в Samocha et al. 29. Очакваният брой de novo мутации в Trio протеин при 4890 индивида със свързани с ASD разстройства е изчислен въз основа на генетично специфична мутация на мутация, определена от Samocha et al. Очакваният брой de novo мутации в Trio-GEF1/DH1 домейна се изчислява чрез преоразмеряване на очаквания брой мутации в Trio с допускане на еднаква вероятност за мутация по гена. Използван е праг на значимост за целия геном P-стойност от -6. За сдвоени електрофизиологични записи на амплитуда на eEPSC е използван тест за подредени рангове на Wilcoxon за сдвоени данни. Тестовете на Wilkoxon Rank Sum бяха използвани за сравняване на електрофизиологичните данни при независими условия. Измерванията за улеснение на сдвоени импулси и данни за плътността на гръбначния стълб бяха анализирани, като се използва съответно сдвоен и несдвоен t-тест на Student. Всички проведени статистически тестове бяха двустранни и с всички тестове P-стойност от