- абстрактно
- Заден план:
- резултатите:
- заключение:
- Въведение
- Материали и методи
- Животни и лечение
- Бягащи писти и мускулни изследвания
- Хиперинсулинемия - евгликемична скоба
- химия
- Статистически анализ
- резултатът
- Краткосрочното лечение с RAP-031 увеличава мускулната маса, силата и контракциите
- Дългосрочното лечение с RAP-031 увеличава мускулната маса, намалява мазнините и повишава чувствителността към инсулин
- дискусия
- Конфликт на интереси
абстрактно
Заден план:
Миостатинът, известен още като фактор на растеж и диференциация 8, е секретиран протеин, който инхибира мускулния растеж. Нарушаването на сигнализирането за миостатин увеличава мускулната маса и намалява глюкозата, но не е ясно дали тези промени са свързани. Ние лекувахме мишки на диета с високо съдържание на мазнини с разтворим актинов рецептор тип IIB (ActRIIB, RAP-031), предполагаем ендогенен сигнален рецептор за миостатин и други лиганди от суперсемейството на TGF-β.
резултатите:
След 4 седмици RAP-031 увеличава мускулната маса и мускулната маса, адхезионната сила и силата на свиване. RAP-031 подобрява способността на инсулина да потиска производството на глюкоза при притискане при мишки с високо съдържание на мазнини, но не променя значително инсулин-медиирания глюкозен клирънс. Ефектът на сенсибилизиране на чернодробния инсулин от лечението с RAP-031 е свързан с повишени нива на адипонектин. Лечението с RAP-031 в продължение на 10 седмици допълнително увеличава мускулната маса и драстично намалява мазнините при мишки на диета с ниско съдържание на мазнини или с високо съдържание на мазнини. RAP-031 потиска производството на чернодробна глюкоза и увеличава периферното усвояване на глюкоза при хранени мишки. За разлика от това, RAP-031 потиска производството на глюкоза без видима промяна в съхранението на глюкоза при мишки с високо съдържание на мазнини.
заключение:
Нашите открития показват, че нарушаването на ActRIIB сигнализирането е жизнеспособен фармакологичен подход към лечението на затлъстяването и диабета.
Миостатинът е член на суперсемейството на TGF-β, което се експресира и секретира предимно от скелетни мускули. 1 Мутациите в загубата на функция на гена на миостатин водят до значително увеличаване на мускулната маса при мишки, говеда, кучета и хора. 1, 2, 3, 4 Биологията на миостатина е фармакологично изследвана чрез инжектиране на неутрализиращи антитела или миостатин пропептид, които увеличават мускулната маса при мишки. 5, 6, 7 Протеините, които се свързват с миостатин, като фололитатин, свързаният с фолистатин ген и серумният протеин-1, свързани с фактори на растеж и диференциация, водят до инхибиране на активността на миостатина и повишен мускулен растеж. В допълнение към ефектите върху мускулите, се съобщава, че миостатинът насърчава или инхибира адипогенезата. 9, 10, 11
Разтворимият ActRIIB/Fc слят протеин (RAP-031) е показал, че увеличава мускулната маса и сила в миши модел на амиотрофна странична склероза. 19 В това проучване ние лекувахме мишки на диета с високо или високо съдържание на мазнини с това съединение и изучавахме връзките във времето между телесния състав и чувствителността към инсулин.
Материали и методи
Животни и лечение
Бягащи писти и мускулни изследвания
Мишките, третирани с RAP-031 или превозно средство, бяха аклиматизирани към модулна бягаща пътека, свързана към индиректен калориметър с отворена верига (CLAMS, Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). След 4 седмици лечение, мишките бяха лишени от храна в продължение на 5 часа и непряка калориметрия беше извършена в покой в продължение на 1 час, последвано от принудително упражнение с бягаща пътека (10 ° 15 минути на 10 m min-1 и след това 2 h на 15 m 1).
Мускулната сила в предните крайници се измерва с помощта на адхезиометър (TSE; Bad, Хамбург, Германия). Мишките бяха обучени да хващат хоризонтален метален прът, докато бяха издърпани за опашките си, а силата беше открита от сензор. Десет измервания бяха определени за всяка мишка и осреднени. Мишките се умъртвяват с въглероден диоксид, мускулите се изрязват и претеглят и мускулната контракция на extensor digitorum longus (EDL) се анализира ex vivo. Отговорите на Twitch и тетанус са оценени, както е описано по-горе. 5, 23, 24 В края на физиологичните проучвания, мускулите бяха бързо замразени в изопентан, охладен в течен азот и нарязани до -80 ° C. Преди рязане. корем, фиксиран със 100% ледено студен метанол. (5 минути) и съхраняван в херметически затворени контейнери при -80 ° С. Разрезите са изследвани след оцветяване с хематоксилин и еозин или АТФаза. Снимките са направени с помощта на микроскоп Olympus BX51, оборудван с камера Magnafire. Морфометричните измервания бяха извършени върху дигитализирани изображения, използвайки софтуера Scion Image 4.02 (Frederick, MD, USA), както беше описано по-рано. 5
Хиперинсулинемия - евгликемична скоба
химия
RAP-031 или третирани с носител мишки на нормална или високомаслена диета в продължение на 4 или 10 седмици, храната се отстранява от 0800 до 1300 часа и след това се жертва с въглероден диоксид. Сърдечната кръв се събира и серумът се съхранява при -20 ° C. Серумна глюкоза и липиди се измерват чрез колориметрични ензимни анализи (Stanbio, Boerne, TX, USA). Инсулинът, лептинът и адипонектинът са измерени чрез ензимни имуноанализи (Crystal Chem, Evanston, IL, САЩ; Linco, St Charles, MO, USA).
Статистически анализ
Ефектът от лечението с RAP-031 върху различни параметри във всяка диетична група беше оценен с помощта на несдвоен t-тест. P 1 ip два пъти седмично) значително увеличава телесното тегло при мишки с нормална диета (31 ± 0,8 срещу 27,1 ± 1,25 g) или високо съдържание на мазнини (35,5 ± 1,34 срещу 29,8 ± 1,42 g) след 4 седмици (Фигура 1а). При мишки, лекувани с RAP-031, се наблюдава значително увеличение на приема на диетична храна (12, 8 ± 0,46 в сравнение с 11,7 ± 0,39 kcal на мишка на ден, P = 0,036) и леко увеличение на диетата с високо съдържание на мазнини (14, 6 ±) 0,69 срещу 13 ± 0,57 kcal на мишка на ден; P = 0,11). Чистата маса беше увеличена с RAP-031, но съдържанието на мазнини не се различаваше значително (Фигури 1б, в). Лечението с RAP-031 повишава гастрокнемиуса, квадрицепсите и EDL мускулната маса (Фигури 1d-f). Морфометричният анализ показа, че RAP-031 не е увеличил значително броя на EDL мускулните влакна в сравнение с лечението с носител (диета за диета: 807, 5 ± 76, 1 срещу 848, 6 ± 99, 7, P = 0,75; диета с високо съдържание на мазнини: 1044 ± 60, 2 срещу 982, 7 ± 27, 4)., P = 0,38). Преди това площта на напречното сечение на EDL влакната се измести надясно и средната площ на влакната се увеличи в отговор на лечението с RAP-031, в съответствие с мускулната хипертрофия (Фигури 2a-d).
Ефекти от 4-седмично лечение с RAP-031 (бяла пръчка) или превозно средство (черна пръчка) върху а ) телесно тегло, б ) бедни и ° С ) мастна маса. ( д - е ) скелетна мускулна маса. Данните са средни ± sem, N = 10; * P ** P *** P
Ефекти от 4-седмичното лечение с RAP-031 (бяла лента) или носител (черна лента) върху напречните сечения на EDL мускулни влакна при мишки при нормална диета за хранене ( а, б ) или диета с високо съдържание на мазнини ( ° С, д ). Данните са средни ± sem N = 5; * Р
Ефекти от 4-седмично лечение с RAP-031 (бяла лента) или превозно средство (черна лента) върху консумацията на кислород (VO 2) а ) на основните условия и б ) на най-добрите условия за упражнения на бягаща пътека, ° С ) якост на сцепление и д, д ) ex vivo свиване на EDL. Данните са средни ± sem N = 5; * P ** P 1 min-1, P = 0,03) при мишки на диета с високо съдържание на мазнини, в съответствие с подобрение в инсулиновата чувствителност (Фигура 4в). Способността на инсулина да потиска HGP (25, 3 ± 2, 9 срещу 33, 7 ± 2, 1 ml kg -1 -1 min-1, P = 0.047) беше увеличена от RAP-031, но не открихме статистически значим ефект RAP-031 върху Rd (69, 2 ± 2, 35 срещу 60, 7 ± 4, 48 ml kg-1 min-1, P = 0, 12) (Фигура 4в) или усвояване на глюкоза от WAT или мускули (Фигура 4г).
Маса в пълен размер
Основно производство на глюкоза и хиперинсулинемично-евгликемична скоба при хранени с фураж (NC) или с високо съдържание на мазнини (HF) мишки, третирани с RAP031 (бяла лента) или носител (черна лента) в продължение на 4 седмици. а ) кинетика на глюкозата при базални и животински условия в NC диета; б ) WAT и прием на глюкоза в мускулите при NC диета; ° С ) кинетика на глюкозата в базални и животински условия при високочестотна диета; д ) Прием на WAT и мускулна глюкоза при високочестотна диета. Данните са средни ± sem N = 5. * P -1 -1 min -1, P = 0.03) и Rd (118 ± 15.3 срещу 62.6 ± 5.5 ml kg -1 -1-1, P = 0.009), докато HGP беше потиснат (5.67 ± 0.63 срещу 16.9 ± 3.17 ml kg-1 min-1, P = 0.008) (Фигура 6а). Стимулираното от инсулин усвояване на глюкоза в WAT и мускулите се увеличава с RAP-031 (Фигура 6b). При диета с високо съдържание на мазнини RAP-031 увеличава GIR (43, 3 ± 3, 9 срещу 27, 8 ± 2, 7 ml kg -1 min-1, P = 0,03) и потиска HGP (6,7 78 ± 0, 5 спрямо 22, 3 ± 4, 8 ml kg -1 min- 1, P = 0, 008) (Фигура 6в), но не променя Rd (50, 2 ± 3, 5 срещу 51, 1 ± 3, 3 ml kg - 1 min-1, P = 0, 12) или абсорбция на глюкоза от WAT или мускули (Фигура 6d).
Ефектите от 10 седмично лечение с RAP-031 (бяла пръчка) или носител (черна пръчка) върху а ) телесно тегло, б ) постна материя, ° С ) мастна маса. Данните са средни ± sem N = 5; * P ** P
Няколко доказателства ни накараха да вярваме, че постнаталното инхибиране на ActRIIB сигнализирането ще увеличи мускулната маса, ще намали мазнините и ще доведе до подобрена глюкозна хомеостаза. Експресията на миостатин и ActRIIB се променя в мастната тъкан и скелетните мускули при затлъстели мишки. 13 Mstn -/- мишки имат увеличена мускулна маса, намалено съдържание на мазнини и подобрена чувствителност към инсулин. По подобен начин трансгенните мишки, свръхекспресиращи миостатинов пропептид, които блокират миостатиновата сигнализация, развиват подобрен глюкозен толеранс и чувствителност към инсулин при диета с високо съдържание на мазнини. Въпреки това, in vivo лечението с миостатин води до противоречиви ефекти върху мускулната маса и мазнините. Zimmers et al. 32 гласи, че подкожното инжектиране на 2 μg миостатин за 7 дни намалява телесните мазнини при женски мишки. Тези резултати не могат да бъдат възпроизведени в друго проучване. 33 Вместо това, 120 μg миостатин, даван за 21 дни, намалява мускулната маса без промяна на мазнините при мишки от див тип или генетично затлъстяване. 33
Нашето проучване разкри интересна динамика между телесния състав и хомеостазата на глюкозата след лечение с RAP-031. Както се очакваше, RAP-031 бързо увеличи чистата и мускулна маса. Това обаче не доведе до значително увеличаване на медиирания от инсулин клирънс на глюкозата в мускулите или мазнините на мишки при диета с високо съдържание на мазнини или с високо съдържание на мазнини. Вместо това 4 седмици лечение с RAP-031 при диети с високо съдържание на мазнини мишки доведоха до значително увеличаване на глюкозопотискащия ефект на инсулина. Интересното е, че ефектът на RAP-031 върху чернодробната сенсибилизация към инсулин е свързан с повишени нива на адипонектин. Адипонектинът се експресира в мастната тъкан, циркулира като комплекси с ниско и високо молекулно тегло и е доказано, че повишава инсулиновата чувствителност. 34 Подобно на нашите резултати, трансгенната свръхекспресия на миостатинов пропептид при мишки, хранени с високо съдържание на мазнини, води до повишени нива на адипонектин. 7 Експресията на иРНК на адипонектин в епидидималната мазнина на трансгенни миостатинови пропептидни мишки е била 12 пъти по-висока, отколкото в котилата от див тип, което предполага, че увеличеният мускулен растеж по някакъв начин стимулира експресията на адипонектин. 7
Ние вярваме, че първото ни проучване показа, че фармакологичното увреждане на сигнализирането на ActRIIB води до намалено съдържание на мазнини, повишена чувствителност към инсулин и увеличена скелетна мускулна маса. Тези резултати показват, че инхибирането на ActRIIB сигнализирането е жизнеспособна стратегия за предотвратяване или лечение на затлъстяване, инсулинова резистентност и диабет. Тепърва трябва да бъдат определени сигналните механизми, чрез които RAP-031 регулира мускулната маса и чувствителността към инсулин. Неотдавнашно проучване показа, че индуцираната от миостатин мускулна атрофия чрез транскрипционните фактори Smad 2 и Smad3. За разлика от това, инхибирането на Smad2/3 стимулира мускулната хипертрофия отчасти чрез mTOR и Akt сигнализиране. 37 Тези резултати бяха потвърдени от друго проучване, което показа, че миостатинът инхибира диференциацията на миобластите чрез потискане на активността на Akt/TORC1/p70S6 киназа. Необходима е допълнителна работа, за да се определи дали тези пътища медиират ефектите на ActRIIB върху инсулиновата чувствителност, затлъстяването и други метаболитни процеси.
Конфликт на интереси
Джефри Укран и Дженифър Лейчи са служители на Acceleron Pharma, която предостави проучване RAP-031.