развитието

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Ектопична експресия на DNMT1 в макрофаги, свързани с атеросклероза
  • Macrophage DNMT1 обостря развитието на атеросклероза в миши модел на DNMT1 Tg
  • Макрофагът DNMT1 увеличава производството на провъзпалителния цитокин
  • DNMT1-медиирано метилиране на PPAR-y промотора
  • Розиглитазон предотвратява производството на възпалителни цитокини, индуцирани от DNMT1 макрофаги и развитието на AS
  • Macrophage DNMT1 насърчава производството на възпалителни цитокини и развитието на AS чрез потискане на PPAR-γ в макрофагите
  • Повишени нива на DNMT1 и намалени нива на PPAR-y в моноцити, свързани с пациенти с AS
  • дискусия
  • методи
  • Събиране и изолиране на моноцити от човешка периферна кръв
  • Поколение на трансгенни мишки
  • Мишки и диета
  • Количествено определяне на атеросклероза
  • Екстракция на перитонеални макрофаги (PM)
  • Изолиране на макрофаги от мастна тъкан или артериална плака
  • Получаване на Ox-LDL
  • Биссулфитна конверсия и пиросеквенция
  • PPAR-y промоторно клониране и анализ на репортерния ген
  • PCR в реално време
  • Уестърн петно
  • Ензиматично свързан имуносорбентен анализ (ELISA)
  • Измерване на плазмените липиди
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Сърдечно-съдови заболявания
  • Метаболитни нарушения

абстрактно

Атеросклерозата (AS), често срещано заболяване в световен мащаб, е причинно свързана със сложни заболявания, включително коронарна болест на сърцето и инсулт 1, 2, 3. Възпалителните реакции, медиирани от макрофаги, играят ключова роля в развитието на AS 4, 5. Натрупването на окислителни липопротеини с ниска плътност (ox-LDL) и макрофаги в артериалната стена играе важна роля в патофизиологията на развитието на AS чрез определяне на образуването на плаки, прогресията и разкъсването 6, 7. В ранните етапи на AS циркулиращите моноцити се привличат към ендотела на кръвоносните съдове. Молекулите на съдова клетъчна адхезия и моноцитният хемоаттрактант протеин участват в хемотаксиса на моноцитите 1, 3. Макрофагите, които се различават от моноцитите в интимата, насърчават развитието на AS чрез секреция на провъзпалителни цитокини (например TNFα, IL-6 и IL-1β), поемане на холестерол и начало на апоптоза 1, 3, 8. Потискането на възпалителната активност на макрофагите е ефективна стратегия за профилактика и лечение на AS 3 .

Макрофагите могат да бъдат класически активирани (M1) или алтернативно активирани (M2) 9, 10. М1 макрофагите са склонни към противовъзпалителен фенотип, който експресира високи нива на противовъзпалителни цитокини (напр. TNFα, IL-6 и IL-1β), докато М2 макрофагите играят противовъзпалителна роля чрез изразяване на високи нива възпалителни цитокини (напр. IL-10 и Arg1) 10. Предишни проучвания разкриха, че диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) или затлъстяването може да предизвика M1 макрофаги, докато Th2 цитокини като IL-4 или IL-13 могат да поляризират M29 макрофагите. Активираният с пероксизомен пролифератор рецептор гама (PPAR-γ) също играе важна роля за насърчаване на поляризацията на M2 11, 12 макрофаги. Регулирането на експресията или активността на PPAR-γ осигурява ефективно средство за контролиране на производството на възпалителни цитокини от макрофаги 11, 12 .

Нови проучвания са фокусирани върху ролята на генната експресия в регулирането на активността на макрофагите 8, 13, 14. Въпреки това, епигенетичната регулация на активността на макрофагите все още не е напълно изяснена. Епигенетичната регулация, включително метилирането на ДНК, свързва факторите на околната среда (напр. Стрес, диета) със сложни нарушения (напр. AS, рак) 15, 16, 17. ДНК метилирането на цитокини, предимно в местата на CpG динуклеотиди, е най-честата епигенетична модификация на генома 18, 19. CpGs често се обогатяват в промоторни области и в първия екзон/5'-нетранслирани региони на гени 20. Промоторите на транскрипционно активни гени обикновено са хипометилирани, докато хиперметилирането на ДНК може да доведе до заглушаване на гени 15, 19. De novo метилирането се медиира от ДНК метилтрансферази (DNMT) 3a и 3b21. След определяне, метилирането на ДНК се поддържа чрез митоза, по-специално чрез поддържащия ензим DNMT1 22, 23. Промяната на глобалното метилиране на ДНК може да регулира хроничното възпалително заболяване 16, 17. Ролите на ДНК метилтрансферазите в поляризацията на макрофагите и развитието на AS обаче не са напълно изяснени.

В това проучване предположихме, че DNMT1 може да регулира производството на възпалителни цитокини в макрофагите и да повлияе развитието на AS. За да тестваме тази хипотеза, създадохме модел на мишка със специфичния за макрофагите трансген DNMT1 или PPAR-γ. Ние също така въведохме AS модел на мишка, като хранехме ApoE-нокаут (ApoE -/-) мишки с атерогенна диета. Използвайки експерименти in vitro и in vivo, ние идентифицирахме ролята на пътя DNMT1/PPAR-γ в развитието на AS.

резултатът

Ектопична експресия на DNMT1 в макрофаги, свързани с атеросклероза

а ) DNMT1, DNMT3a и DNMT3b нива на иРНК в макрофаги, получени от мастна тъкан (ATM) от мъжки мишки C57BL/6, хранени с нормална диета (ND) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 12 седмици (n = 5, *) P -/-) хранени с атерогенна диета в продължение на 12 седмици (n = 5, *** P DNMT1

( а ) Трансгенът DNMT1 значително влияе върху възпалителния път и PPAR сигналния път. Трансгенните перитонеални макрофаги от див тип и DNMT1 бяха изолирани и третирани с LPS (100 ng/ml) в продължение на 24 часа, последвано от Gar микроанализ. След това данните от микрочиповете бяха подложени на KEGG анализ. По-специално, променените пътища на запалване и PPAR сигналната пътека със съответните им P стойности се показват, както е посочено. ( б ) Плазмени нива на цитокини на ApoE -/- или макрофаги DNMT1 трансгенни (Tg DNMT1) ApoE -/- мишки, хранени с AD в продължение на 12 седмици (n = 6, * P DNMT1 мишки (n = 6, * P DNMT1 (n = 6, *) P 11, 12 и беше инхибирано от свръхекспресия на DNMT1 в това проучване, според анализ на експресията на гена на микрочипове. Използвайки PCR анализи в реално време, ние демонстрирахме, че PPAR-γ е предимно експресиран в макрофаги и нивата на трансген mRNA на DNMT1 са значително инхибирани (Фиг. Освен това потвърдихме, че DNMT1 значително потиска експресията на PPAR-y mRNA и неговия целеви ген CD36 (фиг. 4b), но механизмът, свързващ DNMT1 с експресията на PPAR-y, трябва да бъде допълнително изяснен.

( а ) Относителни нива на PPAR-α, β и γ иРНК в трансгенни перитонеални макрофаги WT или DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 за 24 часа. След това клетките се събират за тестове с луцифераза. (N = 3, ** P DNMT1 (n = 5, * P DNMT1 в плазмата на ApoE -/- мишки в AD бяха значително атенюирани чрез лечение с розиглитазон (фиг. 5а), докато Tg DNMT1 - супресивни плазмени нива на IL-10 бяха спасени до голяма степен от розиглитазон (фиг. 5а) По същия начин, открихме същите резултати в макрофаги, изолирани от артериалните плаки на горните AS мишки (Фиг. 5b) и проверихме, че DNMT1 регулира възпалителното производство на цитокини чрез PPAR-γ сигнализиране в третирани с вол-LDL перитонеални макрофаги (Фиг. 5в). vivo лечението с розиглитазон напълно е спасило нарушеното развитие на AS, причинено от трансгена DNMT1 (Фигура 5г).

а ) Плазмени нива на цитокини на трансгенни ApoE -/- или макрофаги DNMT1 (Tg DNMT1) ApoE -/- лекувани с Rosi (ip, 12 mg/100 g телесно тегло/2 дни) и AD в продължение на 12 седмици (n = 6), * P DNMT1 мишка. (n = 6, * P PPAR-γ) модел на мишка (Фиг. 6а, b). Подобно на DNMT1, PPAR-γ трансгенът в макрофаги не е имал значителен ефект върху наддаването на телесно тегло (фиг. 6в) или върху плазмените липидни профили (напр. Свободен и общ холестерол, триглицериди, фосфолипид и холестеролов естер) (фиг. 6г ). Въпреки това, плазмените нива на възпалителни цитокини, индуцирани от Tg DNMT1, се предотвратяват предимно чрез добавянето на Tg PPAR-γ в модела ApoE -/- AS (Фиг. 6д). В същото време, нивата на IL-10 в плазмата Tg DNMT1 се спасяват от Tg PPAR-γ плазмид (фиг. 6д). Освен това проверихме регулаторната роля на пътя DNMT1/PPAR-γ при производството на възпалителни цитокини в макрофаги, получени от артериална плака (фиг. 6е) и стимулирани от вол-LDL макрофаги (фиг. 6е, ж). За по-нататъшно наблюдение на ефектите на DNMT1/PPAR-γ пътя в развитието на AS, ApoE -/- Tg DNMT1 мишки бяха кръстосани с ApoE -/- Tg PPAR-γ мишки, за да се създаде модел на двойна трансгенна мишка. Както се очаква, нарушената прогресия на AS поради DNMT1 Tg е предотвратена от PPAR-γ Tg (фиг. 6h).

( на ) Относителни нива на mRNA DNMT1 ( а ), PPAR ( б ), IL-ip ( ° С ), IL-6 ( д ), TNFα ( д ) и IL-10 ( е ) в изолирани моноцити от периферна кръв от пациенти с AS или здрави донори (n = 25, * P 17, 27. Въпреки това, целевите гени за метилиране на ДНК и тяхната роля в развитието на AS остават неясни. В това проучване установихме, че DNMT1 е екктопично експресиран в AS-асоциирани макрофаги: DNMT1 макрофагът изостря развитието на AS чрез потискане на PPAR-γ-медиирани противовъзпалителни ефекти и тези открития представляват потенциални терапевтични цели за AS.

Установихме, че експресията на ДНК метилтрансферази (DNMT3a и DNMT3b) в макрофаги, получени от мастна тъкан, се предизвиква чрез лечение с HFD или фактори, свързани със затлъстяването. Тази констатация е подобна на констатациите от предишно проучване 17. По-специално, открихме, че индукцията на DNMT1, поддържащият ензим на метилиране на ДНК 22, 23, е по-изразена в макрофагите, отколкото стимулирането на DNMT3a и DNMT3b от HFD. По-интересното е, че DNMT1, но не и DNMT3a или DNMT3b, беше индуциран в модела ApoE -/- AS. Предишно проучване предполага, че провъзпалителни фактори (напр. Наситена свободна мастна киселина) или противовъзпалителни цитокини (например IL-4) могат да стимулират или потискат експресията на DNMT3b (не DNMT3a). Други проучвания 17, 28, заедно с нашите открития, предполагат, че експресията на ензими, свързани с метилирането на ДНК, се регулира индивидуално от различни фактори. Подробните молекулярни механизми, свързващи HFD или ApoE с индукцията на DNMT1, DNMT3a и DNMT3b, остават неясни и трябва да са много сложни.

Целите на DNMT1 са универсални 18, 23. Използвайки анализ на микрочипове и KEGG, установихме, че PPAR сигнализирането е значително повлияно от DNMT1. Чрез допълнително потвърждение открихме, че PPAR-γ, но не и PPAR-α или β, се експресира предимно и се регулира от DNMT1 в макрофаги. За щастие открихме, че PPAR-γ, след DNMT1, може ефективно да регулира производството на възпалителни цитокини в макрофаги и развитието на AS в модел на мишка. Специфичният PPAR-y агонист също играе защитна роля при прогресията на AS. Всъщност серия от възпалителни цитокини (напр. TNFa, IL-1β, IL-6 и IL-10) са модулирани от PPAR-y 11, 12. Въпреки това, цитокинът, който е най-важен за регулирането на активността на макрофагите и развитието на AS след веригата DNMT1/PPAR-γ, остава неясен. За да се обърне внимание на този проблем в бъдеще, трябва да се определи специфичното взаимодействие на тези цитокини с антитела или нокаут модели на мишки.

Взети заедно, нашите данни разкриват извънматочна експресия на DNMT1 в AS-свързани макрофаги. За първи път демонстрирахме, че DNMT1 насърчава провъзпалително активиране на AS-свързани макрофаги и AS прогресия в модели на мишки. Също така открихме, че PPAR-γ е цел за DNMT1-регулирано метилиране на ДНК и участва в DNMT1-медиирано хронично възпаление и развитие на AS. Тези открития изясняват стратегиите и леченията за превенция на АС, които да се използват за лечение на АС.

методи

Събиране и изолиране на моноцити от човешка периферна кръв

Поколение на трансгенни мишки

DNMT1 на мишката или PPAR-y cDNA беше субклонирана в конструкция, съдържаща човешкия CD11b промотор, за да насочи експресията на специфичния за макрофаги ген 29, 30. Трансгенната конструкция DNMT1, специфична за макрофаги (Tg DNMT1) или PPAR-γ (Tg PPAR-γ), беше микроинжектирана в ембриони C57BL/6 съгласно стандартни протоколи и основателите бяха кръстосани с див тип щам C57BL/6. Tg DNMT1 мишки, Tg PPAR-y мишки бяха кръстосани с Tg DNMT1 мишки, за да се получат двойни трансгенни мишки (Tg DNMT1 + PPAR-y). Тези експерименти са одобрени от Институционалния комитет по грижа и използване на животните в Третия военномедицински университет и са извършени в съответствие с одобрените насоки.

Мишки и диета

Всички експерименти с животни са одобрени от Комитета по институционални грижи за животните и тяхната употреба в Третия военномедицински университет и са извършени в съответствие с „Наръчник за грижа и използване на лабораторни животни“, издаден от Националния здравен институт на САЩ ( публикация). не. 85-23, ревизиран 1996). Мишките бяха държани в съоръжение без патогени с 12-часов светлинен цикъл, 12-часов тъмен цикъл и снабдени с храна и вода ad libitum.

ApoE нокаутиращи мишки (ApoE -/-) на фон C57BL/6 са закупени от лабораторията Jackson. Мишки от див тип C57BL/6 са закупени от Центъра за животни на Третия военномедицински университет. За да се изследва ролята на DNMT1 или PPAR-γ макрофагите в развитието на AS, Tg DNMT1 или Tg PPAR-γ мишки се свързват с ApoE -/- мишки. Шестседмични мишки бяха хранени с атерогенна диета (диета с високо съдържание на мазнини и холестерол: 45% енергия от свинска мас [16: 0 = 23, 3%, 18: 0 = 15, 9%, 18: 1 = 34, 8%, 18: 2 = 18,7%] и 0,2% (тегло/тегло холестерол) 31. След 12 седмици атерогенна диета, мишките се жертват за плазма, аорта, епидидимална мастна тъкан и други тъкани.

Количествено определяне на атеросклероза

Според предишното проучване 32, мишките са били жертвани след 12 седмици хранене с атерогенна диета, за да се анализира развитието на атеросклероза в аортния корен на мишката. Кръвоносната система беше перфузирана с PBS (100 mm Hg) в продължение на 10 минути преди отстраняване на сърцето и аортата. Сърцето плюс аортния корен и аортната дъга бяха изрязани, а серийните секции на аортния корен бяха изрязани с помощта на криостат Leica CM3050. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и 0,5% маслено червено О (Sigma-Aldrich), за да се оцени атеросклеротичната интимна зона на аортния синус. Площта на атеросклеротичните лезии и О-положителната зона на Oil Red са количествено определени с помощта на софтуера Image-Pro Plus (Media Cybernetics).

Екстракция на перитонеални макрофаги (PM)

Първичните PM са изолирани, както е описано по-рано 13. Накратко, на всяка мишка се инжектира (ip) с 2 ml 2,9% тиогликолат (# T9032, Sigma) на ден 1 и се жертва на ден 3. След ip инжектиране на 5 ml прясна среда DMEM, перитонеалните клетки се събират в културални съдове. Два часа по-късно плаващите клетки се измиват с PBS и прикрепените PM клетки се използват за друг експеримент.

Изолиране на макрофаги от мастна тъкан или артериална плака

Изолирането на стромални съдови клетки от мастна тъкан се извършва, както е описано по-горе. Изолирането на макрофаги (F4/80 + клетки) от стромални съдови клетки се извършва чрез магнитна имуноафинитетна изолация с анти-F4/80 антитела, конюгирани с магнитни гранули (MACS; Miltenyi Biotec). Клетките се изолират, като се използват колони за позитивна селекция (MACS), преди да се приготвят клетъчни лизати за анализ на иРНК чрез PCR в реално време.

За събиране на аортни имунни клетки, аортите се събират, пречистват и усвояват, за да освободят аортните клетки, както е описано по-рано 33. След това F4/80 + клетки се събират селективно, както е описано по-горе.

Получаване на Ox-LDL

PCR в реално време

Общите РНК бяха изолирани, използвайки комплект peqGold Total RNA, включително разграждане на DNase (Peqlab, Erlangen, Германия). РНК се транскрибират в cDNA, използвайки Omniscript (Qiagen, Hilden, Германия). MRNA нивата се определят чрез количествена PCR в реално време (qPCR). GAPDH се използва като вътрешен контрол и нивата на генна експресия се изчисляват, използвайки метода delta-Ct. Нивата на иРНК за всеки ген представляват количество спрямо количеството в контролната група, което е произволно стандартизирано до едно. Последователностите на праймерите, използвани за qPCR, се предлагат при поискване.

Уестърн петно

Тъканните и клетъчните протеини се екстрахират с RIPA лизисен буфер (# P0013, Beyotime, Китай) и се определят количествено с помощта на BCA комплект (# P0009, Beyotime, Китай). Протеиновите проби се разделят чрез 10% SDS полиакриламиден гел електрофореза и се прехвърлят в PVDF мембрана (Millipore). След блокиране на 5% мляко в буфериран с Tris физиологичен разтвор, съдържащ 0,1% Tween-20 (TBST), мембраната се инкубира с първични антитела към DNMT1 (# 5032, Cell Signaling Technology). Комплексът антиген-антитяло е открит от Western Lightning Plus-ECL (PerkinElmer) с GAPDH (# 5174, Cell Signaling Technology) като вътрешен контролен протеин. Сигналите бяха заловени с помощта на система Bio-Rad ChemiDoc MP (170-8280).

Ензиматично свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Плазмените цитокини се измерват, като се използват TNF-α (# MTA00B), IL-1β (# MLB00C), IL-6 (# M6000B) и IL-10 (M1000B) ELISA комплекти от R&D системата съгласно протоколите на производителя.

Измерване на плазмените липиди

Следвани са протоколите на производителя за измерване на нивата на триглицеридите (триглицериден реагент, Sigma # T2449; свободен глицеринов реагент, Sigma # F6428), общ холестерол (течни реагенти за холестерол, Pointe Scientific Inc. # C7510-120), свободен холестерол (WaKo # 435) . -35801) и фосфолипиди (фосфолипиден реагент С, Wako # 433-36201) в плазмени проби.

Статистически анализ

Всички данни са изразени като средно ± SEM и са анализирани чрез еднопосочен ANOVA или двустранен тест на несдвоен студент. За всеки параметър от всички данни резултатите бяха значими при * P