абстрактно

Човешки адипоцити могат да бъдат получени in vitro чрез диференциация на човешки преадипоцити или мезенхимни стволови клетки (hMSC). Въпреки че е функционално подобен на прясно изолирани клетки, не е направено подробно сравнение на различните типове клетки. Антилиполитичният α2A-адренорецептор (AR) и разграждащият цАМФ ензим фосфодиестераза-3В (PDE3B) участват в фината настройка на липолизата, но малко се знае за тяхната роля в човешките адипоцити или дали тяхната експресия и/или функция се различава ... в мастните клетки от различни предшественици.

методология:

Ефектите от инхибирането на α2A-AR и PDE3B при зрели адипоцити бяха определени и сравнени с ефектите в диференцирани преадипоцити и мастни клетки, получени от hMSC. Експресията на гена се определя чрез PCR в реално време и експресията на протеини чрез Western blot.

резултатите:

Норадреналин (NA) стимулира липолизата в преадипоцитите и зрелите адипоцити, но значително намалява липолизата в диференцирани адипоцити, получени от hMSCs. Това се дължи на силна стимулация на α2A -AR след съвместна инкубация с NA и инхибитора и -2-AR-йохимбин, възстановената от NA липолиза. Редът на отговора на Йохимбин беше hMSC> преадипоцити> зрели адипоцити. Въпреки че експресията на α2-AR тРНК е най-висока при зрелите адипоцити, няма разлика в нивата на α2A -AR протеин между клетъчните типове. За разлика от тях, експресията на G a2 mRNA и протеините е значително по-висока при получените от MSC адипоцити, което предполага, че разликите в отговора на инхибирането на α2A-AR се намират на нивото на пострецептора. Инкубацията с cAMP аналогов 8-бромо (8b) cAMP повишава липолизата в hMSC-получени адипоцити, докато съвместната инкубация с PDE3-специфичния инхибитор OPC3911 не променя липолитичния ефект. За разлика от това, OPC3911 значително повишава 8bcAMP-индуцирана липолиза в преадипоцити и зрели адипоцити. Отговорът на инхибирането на PDE3B беше; зрели адипоцити> преадипоцити> находка на hMSC, което значително корелира с експресията на PDE3B иРНК, както и ензимната активност.

заключение:

Въпреки че диференцираните адипоцити с различен произход показват сходни функционални характеристики, съществуват значителни разлики в регулирането на липолизата с маркиран α 2A-AR и по-слабо изразен ефект на PDE3B в MSC адипоцитите.

Регулирането на нивата на сАМР също се постига на различно ниво чрез фосфодиестерази (PDE), група ензими, които разграждат сАМР при активиране от антилиполитични хормони като инсулин. Основният подтип на PDE в човешката мастна тъкан е фосфодиестераза-3B (PDE3B). Инсулиновата стимулация в адипоцитите води до автофосфорилиране на инсулиновия рецептор и свързване на адаптерни протеини, включително инсулиновия рецептор-1 субстрат (IRS-1). Адаптерните протеини придобиват няколко ефектора, включително фосфатидилинозитол трифосфат киназа (PI3-K). Фосфатидил трифосфатният липид, образуван чрез фосфорилиране на PI3-K, функционира като котва молекула и набира PDK1/2 киназа в плазмената мембрана. PDK1/2 фосфорилира протеин киназа В (PKB), ензимът, отговорен за фосфорилирането и активирането на PDE3. Тази сигнална каскада води до намалени концентрации на сАМР, което води до намалена активност на РКА и дефосфорилиране на HSL. В човешките адипоцити индуцираната от инсулин антилиполиза се неутрализира напълно от селективния PDE3 инхибитор OPC3911. В комбинация с други проучвания6, това предполага, че активирането на PDE3 е основен механизъм на in vivo антилиполитичния ефект на инсулина.

Материали и методи

Адипоцитна клетъчна култура

В зрели култури на адипоцити и преадипоцити мазнините са получени от 13 жени, претърпели козметична мастектомия или коремна операция. Те са били на възраст от 28 до 62 години, с индекс на телесна маса (ИТМ) между 24 и 51 kg/m 2. Проби от мастна тъкан са получени от хирургичните отделения на болница Huddinge и болница Danderyd. Взети са проби от подкожното депо и коремните депа на пациента. Комитетът по етика на болницата одобри проучването. Получено е информирано съгласие от всеки субект. Зрели адипоцити са изолирани според Rodbell. 13 След изолиране, клетките се промиват с фосфатен буфер на Krebs-Ringer (KRP) pH 7, 4: 0.9% NaCl, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.154 M KCl, 0.1 M CaCl 2, 0.154 M MgSO 4, съдържащ 0.1% говеда серумен албумин (BSA) pH 7.1, 4. Адипоцитите след това се разреждат в KRP, съдържащи 2% BSA (FFA акцептор), глюкоза (гориво, 1 mg/ml) и аскорбинова киселина (антиоксидант, 0.1 mg/ml).

Човешки преадипоцитни култури бяха създадени и диференцирани, както е описано по-горе 14 в 6-, 12- или 24-ямкови плаки в 37 ° С инкубатор с 5% CO 2. Липолизата се оценява на 16-ия ден от диференциацията.

Човешка MSc култура

Оценка на диференциацията

Предиадипоцитната и hMSC диференциация се оценява чрез определяне на активността на глицерол-3-фосфат дехидрогеназата (GPDH) и оцветяване със специфично за триглицеридите червено червено О багрило, както е описано по-горе. 10

Изолиране на РНК и PCR в реално време

липолиза

Уестърн петно

Анализ на активността на PDE3B

PDE анализът се основава на следната реакция: сАМР до ​​АМР (катализиран от PDE) и след това превръщане на АМР в аденозин чрез 5'-нуклеотидаза. Диференцираните преадипоцити и hMSCs, както и зрелите адипоцити се хомогенизират в буфер, съдържащ 50 mM TES, 250 mM захароза, 1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA (рН 7,5) и Complete (Roche Diagnostics, Швейцария). Клетъчните хомогенати се инкубират при 30 ° С в продължение на 20 минути в общ обем от 300 μl, съдържащ 50 mM HEPES (рН 7.4), 0.1 mM EGTA и 0.5 μM [3 H] cAMP. Змийска отрова (Crotalus atrox, Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ), която съдържа 5'-нуклеотидазна активност, беше добавена при концентрация от 0.4 mg/ml и клетъчните хомогенати бяха инкубирани при 37 ° С в продължение на 20 минути. Активността на PDE3 се определя като количеството хидролизиран сАМР и се изразява на mg общ протеин. Концентрацията на протеин в клетъчните хомогенати се определя с помощта на RC/DC протеинов анализ (Biorad, Hercules, CA, USA).

Статистически анализ

Стойностите се отчитат като средно ± стандартно отклонение (sd) за данните от анализа на иРНК и PDE и като средно ± стандартна грешка (se) за липолиза. Те бяха сравнени със студентския несдвоен t-тест или непараметричния тест на Kruskal-Wallis, както е посочено от стандартните софтуерни пакети.

Наркотици и химикали

BSA фракция V (партиден номер A-9418), 8-bromocAMP, глюкоза, глицерол киназа, NA, Oil Red O и йохимбин са получени от Sigma Chemical (Sigma, St. Louis, MO, USA). OPC 3911 е получен от Otsuka Pharmaceuticals, Япония. Всички използвани химикали са с най-висока степен на чистота, налични в търговската мрежа.

резултатът

Амипоцитите, получени от hMSC, показват подчертан α2A-AR ефект, но не и PDE3B ефект

диференциална

Липолиза в адипоцити, получени от hMSC. Клетките се стимулират или с NA (NA) със или без α2A -AR блокер йохимбин (NA + Yoh) или cAMP аналог 8pcAMP, чувствителен към фосфодиестераза 3 (PDE3) със или без PDE3-специфичния инхибитор OPC3911 (8bcAMP + OPC). Освобождаването на глицерол се измерва в среда след 3 часа инкубация и се изразява по отношение на активността на GPDH и концентрацията на протеин. Базалната липолиза се коригира до 100% за всеки експеримент, който се повтаря поне четири пъти с клетки от различни донори. Поради силния антилиполитичен ефект на α2A -AR, NA намалява липолизата в сравнение с контролните клетки. В присъствието на йохимбин NA-стимулираната липолиза се възстановява повече от три пъти на базално ниво. За разлика от това, добавянето на OPC към 8bcAMP няма значителен ефект върху липолитичната скорост (***, статистически значимо в сравнение с базалната Р липолиза

Липолиза в диференцирани преадипоцити. Имайте предвид, че индуцираната от NA липолиза се засилва в присъствието на йохимбин. По същия начин ефектът на 8bcAMP е значително подобрен в присъствието на OPC3911 (***, статистически значим в сравнение с базалната Р липолиза

Липолиза в прясно изолирани зрели адипоцити. Клетките бяха стимулирани със същите лекарства, както на Фигура 1. Освобождаването на глицерол беше измерено в средата след 2 часа инкубация и изразено спрямо липидното съдържание в грамове. Обърнете внимание на малко по-слабо изразения ефект на инхибиране на α2A -AR и подчертания ефект на инхибиране на PDE3B (* P *** P преадипоцити> зрели адипоцити), докато обратната активност (зрели адипоцити> преадипоцити)> HMSC-адипоцити се наблюдава при PDE3B активност).

Сравнение на инхибиторните ефекти при различни видове клетки. Антилиполитичният ефект на α2A -AR се изразява като процентно увеличение на липолизата в третирани с NA + йохимбин клетки в сравнение с клетки, инкубирани само в NA. Антилиполитичният ефект на PDE3 се изразява като процентно увеличение на липолизата на 8bcAMP + третирани с OPC клетки в сравнение с 8bcAMP. Антилиполитичният ефект на α2-адренорецепторите е значително по-нисък при зрели адипоцити в сравнение с диференцираните hMSC (P = 0.002, t-тест на Student). ). За разлика от това, антилиполитичният ефект на PDE3 е значително увеличен при зрели адипоцити в сравнение с диференцирани hMSC (P = 0,036, t-тест на Student).

Изображение в пълен размер

Експресия на α2A -AR и Galfa иРНК и протеин

Експресия на Messenger и протеини в адипоцити от различен произход. Експресията на a2A -AR (a) и Gai2 (b) тРНК се оценява в изолирани адипоцити, преадипоцити и hMSCs. Експресията на гени беше стандартизирана до 18S рРНК. Стойностите са показани като средна стойност ± sd (* = P

За разлика от намаления ефект на α2A -AR инхибирането при зрели адипоцити, ефектът на PDE3 изглежда се засилва. Това най-вероятно се дължи на повишена експресия на PDE3B иРНК, водеща до повишена активност. Причината за това не е ясна. PDE3 е основен ефектор на антилиполитичния ефект на инсулина. Следователно повишената активност на PDE3 може да отразява по-напреднало ниво на липолитична регулация в зрелите мастни клетки, където липолизата се регулира не само от катехоламини, но и от инсулин. Необходими са обаче допълнителни проучвания, за да се определи дали разликите в експресията зависят от първичните разлики между клетъчните типове или поради in vitro процедура за диференциация.

В обобщение показахме, че функциите на α2A -AR и PDE3B се различават в зависимост от адипогенния произход на узряващите мастни клетки. Инхибирането на липолизата от α2A -AR и PDE3B изглежда е диференцирано важно за адипоцитите, получени от различен клетъчен произход. В получените от hMSC адипоцити преобладава ролята на α2A -AR, докато в зрелите мастни клетки преобладава активността на PDE3B. И двата пътя са важни за преадипоцитите. Тези сигнали могат да играят роля в натрупването на липиди по време на узряването на адипоцитите, за да защитят незрелите мастни клетки чрез инхибиране на неконтролираното освобождаване на съхранената енергия. Нашите резултати показват, че има качествени разлики между човешките адипоцити, получени от различни прекурсорни клетки и че трябва да се внимава при тълкуване на резултатите от in vitro проучвания на адипоцити.

Благодаря

Тази работа беше подкрепена от фондациите на Åke Wiberg, Tore Nilsson, Signe и Olof Wallenius, Magnus Bergvall, Åhlens и Novo Nordisk, Шведската медицинска асоциация, Шведския изследователски съвет, Шведската диабетна асоциация, Фондацията Tobias и Шведската фондация за рак .,