елементи

абстрактно

Чревната микробиоза взаимодейства с физиологията на гостоприемника чрез много предполагаеми метаболитни и регулаторни пътища, които засягат здравето и заболяванията 1, 2. Микробиозата участва в развитието на индуцирано затлъстяване, но основните механизми не са напълно изяснени 3, 4 .

Фибрите са защитени срещу развитието на затлъстяване, причинено от диета 5, 6, 7. Ефектите на фибрите до голяма степен се дължат на тяхната ферментация от чревни бактерии и поглъщането на метаболити като късоверижни мастни киселини (SCFA), епител на дебелото черво, тъкани на тъканите и периферни органи. Например, бутиратът стимулира чревната глюконеогенеза от метаболизма на пропионат и SCFA в черния дроб регулира глюкозния и липидния метаболизъм и енергийната хомеостаза 8, 9. Съобщава се, че диетичните фибри и SCFA ограничават наддаването на тегло поради намален прием на храна при гризачи 10, 11, 12 и косвено са свързани с наддаване на тегло при хора 13, 14, 15 .

Диетичните фибри са различни полизахариди и олигозахариди от растителен произход. Чревните бактерии се различават по способността си да разграждат и използват диетични фибри и следователно различните диетични фибри значително променят състава на чревната микрофлора 16. Целта на нашето проучване беше първо да се определи дали седем различни диетични фибри (ечемичен бета-глюкан, ябълков пектин, инулин, естер на инулинова киселина, инулин пропионат естер, инулин бутират естер или комбинация от инулин пропионат естер и инулин бутират естер), избрани след проучването за ферментация in vitro.17 са еднакво защитни за предотвратяване на затлъстяване, предизвикано от диета при мишки, и дали това е свързано със специфични профили на цекалните бактерии. Тъй като един от възможните механизми на действие на фибрите е чрез производството на SCFA, ние също включихме естулинови естери на инулина, за да оценим ролята на отделните SCFA 18, 19. Втората цел беше да се определи свързаната регулация на експресията на гел влакна в цекума, първия орган, засегнат от разликите в цекусните бактерии и черния дроб, порталния орган между червата и системната циркулация и дали това може да бъде свързано с бактериални профили.

За тази цел използвахме добре дефиниран модел на диета, предизвикано от затлъстяване. В миналото показахме, че мъжките мишки C57B1/6J на 12 седмична възраст (24-25 грама) бързо и предсказуемо увеличават телесното тегло, затлъстяването и съдържанието на липиди в черния дроб, когато се хранят с HFD 20. Използвайки този модел за настоящото проучване, ние манипулирахме диетичните въглехидрати, за да заменим дела на царевичното нишесте и целулозата в HFD с различни ферментиращи влакна (ечемичен бета-глюкан, ябълчен пектин, инулин, естер на инулиновата киселина, естер на инулин пропионат, естер на инулин бутират) . или комбинация от инулин пропионатен естер и инулин бутират естер). Измервахме приема на храна и затлъстяването едновременно с анализа на профилите след интервенция на бактериите, събрани от цекално съдържание, като използвахме последователността на Illumina MiSeq и свързаната експресия на гостоприемния ген в цекума и черния дроб.

резултатът

Състав на тялото и прием на храна

мишки

Плазмени отговори на лептин, инсулин, резистин и PYY при мишки, хранени с високомаслена диета (HFD), HFD, където 10% тегловни въглехидрати (5% царевично нишесте, 5% целулоза) са заменени с бета глюкан (HFD + bglucan), ябълков пектин (HFD + инул Р), инулин (HFD + инул), естер на инулинова киселина (HFD + инул А), естер на инулин пропионат (HFD + инул Р), естер на инулин бутират (HFD + инул В), инулин пропионат и бутират естер, 5% всеки (HFD + inul PB) и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). Средно аритметично ( A ) Лептин, ( Б. ) Инсулин, ( ° С ) Резистин (n = 5-7) и ( д ) PYY (n = 3–7). Значителен (стр

Изображение в пълен размер

Бактериалните профили на цекума са групирани отделно въз основа на диетата за повечето животни. LFD и HFD без добавени влакна бяха групирани заедно, което показва, че наличието на влакна е основен двигател на общия състав на общността. Анализите на Metastata и LEfSe (степен на ефекта от линейния дискриминантен анализ) потвърдиха, че има голям брой значителни разлики в таксоните на компонентите между двете групи и всички групи, съдържащи влакното заедно (допълнителен набор S4). За разлика от тях, двете диетични групи без добавени фибри (LFD и HFD) показват по-малко значими разлики между тях (допълнителен набор S5). Също така забелязахме, че четирите инулинови естери са разделени на две ясни групи, с HFD + inul A/HFD + inul P и HFD + inul B/HFD + inul PB, групирани заедно (Фиг. 3B, допълнителен набор S3). Два различни метода на клъстериране (Jaccard, който съдържа само присъствието/отсъствието на OTU, и Bray Curtis, който също включва пропорционалното изобилие на всеки OTU при сравняване на разликите) разкриват силно значим ефект от диетата (P 1,5-кратна разлика (P 1,5 -кратна разлика (P

Валидиране на данни от микрочипове и отговор при мишки, хранени с високомаслена диета (HFD), където 10% тегловни въглехидрати (5% царевично нишесте, 5% целулоза) са заменени с бета глюкан (HFD + bglucan), ябълков пектин (HFD) . + пектин), инулин (HFD + инулин), естер на инулинова киселина (HFD + инулин А), естер на инулин пропионат (HFD + инулин Р), естер на инулин бутират (HFD + инулин В), естер на инулин пропионат и бутират (HFD + PB) и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). ( A ) RT Profiler PCR Масив от избрани целеви гени, които показват променена генна регулация в отговор на HFD + inul и HFD + PB от анализ на микрочипове на цекума. Промяната в състава се изчислява по отношение на мишки, хранени с HFD, като се използва средната генна цел, нормализирана на UBE2D2 (n = 6). ( Б. ) Експресия на гена Enho в черния дроб на мишки, хранени с HFD + DF или LFD спрямо HFD. Промяната в състава се изчислява по отношение на мишки, хранени с HFD, като се използва средната стойност на Enho, нормализирана на UBE2D2 (n = 6). ( ° С ) Нива на адропин в черния дроб. Т-тестът на Student на базата на делта CT стойности беше използван за сравняване на тестове с HFD-хранени мишки. * P ** P *** P 1, 5-кратни разлики P

Променени онтологии и пътища, свързани с известни гени, показващи 1,5-кратни разлики (P

Експресия на гени на SAA1 и SAA2 в сравнение с мишки, хранени с високо съдържание на мазнини (HFD) в цекума и черния дроб на мишки, хранени с HFD, където 10% тегловни въглехидрати (5% царевично нишесте, 5% целулоза) са заменени с бета глюкан (HFD + bglucan), ябълков пектин (HFD + инулин Р), инулин (HFD + инулин), естер на инулинова киселина (HFD + инулин А), естер на инулин пропионат (HFD + инулин Р), естер на инулин бутират (HFD + инулин В ), естер на инулин пропионат и бутират, по 5% (HFD + PB) и диета с ниско съдържание на мазнини (LFD). Експресията на гена се изчислява спрямо HFD-хранени мишки, като се използва средната генна цел, нормализирана към UBE2D2 (n = 5-6). Тестът на студента се прилага за сравнение на тестове с HFD-хранени мишки. * P ** P *** P 21. Целулозата, включена в диетите (International Fiber Corporation), няма калорична стойност за гостоприемника и е заменена с диетични фибри в диетата HFD + DF. Като се има предвид, че няма забележима промяна в кумулативния прием на храна между HFD и диетата с HFD, съдържаща диетични фибри (фиг. 1D), заедно със защитата срещу индуцирано от диетата затлъстяване (фиг. 1A-C), нашите резултати показват, че чистите калории могат да бъдат нисък.

SAA1 и SAA2, основни изоформи на острата фаза на серумния амилоид А, се експресират от лумеалния повърхностен епител, облицован с дебело черво 32 и се смята, че осигуряват антибактериална роля, която помага да се поддържа епителната имунна хомеостаза 32. Кодираните протеини се секретират в лумена, играят роля за естественото разпознаване на грам-отрицателни бактерии, намаляват жизнеспособността на бактерии 32, 33 и са свързани с намален риск от възпалителни заболявания на червата 32. SAA1 и SAA2 бяха понижени в черния дроб в отговор на HFD + DF. HFD увеличава възпалителния отговор в черния дроб с увеличаване на циркулиращия SAA 20. Намаленият възпалителен отговор в черния дроб се доказва от по-ниски нива на SAA1 и SAA2. Проучванията показват, че увреденият чревен епител води до повишени нива на циркулиращ SAA най-вероятно от черния дроб 34. По този начин, противоположните ефекти на фибрите върху SAA1 и SAA2 в цекума и черния дроб могат да бъдат свързани (фиг. 5Е).

Диетични фибри, регулиращи Tex19. 1, който има ограничена експресия в плюрипотентни стволови клетки 35 и инхибира ретротранспозоните 36. Тексас19. 1 потенциално стабилизира генома на чревните стволови клетки по време на репликация и регенерация на чревния епител, свързвайки приема на фибри с противоракови ефекти.

методи

Животни и диетична намеса

Бактериален анализ на цекула

Геномната ДНК (gDNA) беше извлечена от цекума, използвайки FastDNA® SPIN Kit за почва (MP Biomedicals, Illkirch, Франция). Общото изобилие на цекални бактерии се изчислява след диетичните интервенции чрез количествена PCR и V3-V4 регионът на бактериални 16S рРНК гени се секвенира на Illumina MiSeq с помощта на v3 поточна клетка с 2 × 300 bp сдвоени крайни показания (пълни подробности за последващия анализ използваните стъпки са налични в допълнителен файл S2). Данните за секвениране, генерирани по време на това проучване, са налични в базата данни на SRA под присъединяването към SRA SRP117745 (достъпна на //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRP117745).

Плазмени хормони

Хормоните се измерват в плазмата от сърдечна пункция (CP) или от чернодробна портална вена (HPV) (n = 4–8), събрани с включване на протеазен инхибиторен коктейл за обща употреба (Sigma cat # P2714), използвайки Millipore's MILLIPLEX MAP Mouse Metabolic Hormone Magnetic Панел от мъниста (Merck Millipore, Feltham, Великобритания).

Чернодробна мазнина

Общо мазнини бяха извлечени от левите чернодробни лобове въз основа на метода на Folch et al. 43 и изчислено тегло на мазнини на микрограм чернодробна тъкан.

Анализ на цял геном на микрочипове

Общата РНК, извлечена от черния дроб и сляпото черво с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, Crawley, UK), е микрочисена със SurePrint G3 Mouse GE 8 × 60 K Microarray G4852A (Agilent Technologies, UK) (Допълнителен файл S2). Данните се депозират в Gene Expression Omnibus 44 на NCBI и са достъпни чрез GEO сериен номер за присъединяване GSE106375 (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE106375). Подробности за статистическия анализ на данните от микрочипове са предоставени в допълнителен файл S2.

Потвърждаването на микрочиповете идентифицира различия в генната експресия, използвайки специално проектирани PCR масиви RT Profiler

Гени, показващи променени отговори на HFD + инулин или HFD + inul PB естери в цекума, бяха идентифицирани от анализ на микрочипове и валидирани с помощта на специално проектиран RT Profiler PCR Array (Qiagen) (Допълнителен файл S2).

PCR в реално време

Допълнителни шаблони за cDNA за PCR анализи в реално време бяха изготвени от Superscript II (Invitrogen), анализи с обратна транскрипция на обща РНК и Taqman бяха проведени с дуплекс мишена и референтен ген UBE2D2. (Допълнителен файл S2).

Адропин на черния дроб (Enho)

За измерване на адропин в съответствие с инструкциите на производителя се използва ензимно-свързан имуносорбентен тест (ELISA) (Cusabio USA). (Допълнителен файл S2).

Статистически анализ

Подробности за статистическия анализ на секвенирането на цекалната микробиота, данните за микрочипове на цекума и черния дроб могат да бъдат намерени в допълнителен файл S2. Други данни са представени като средно ± SEM и са анализирани с помощта на GenStat (Gen Stat®13th Edition (VSN International, Ltd., Hemel Hempstead, UK), освен данните RT-PCR, които са анализирани в логаритмична (делта CT) скала, но представени като сгъваеми промени (анти-регистрирани разлики) без стандартни грешки. Сравнението на диетична група с група с високо съдържание на мазнини беше проведено с помощта на t тестове. Влиянието на един фактор и сравнения между диетичните групи бяха тествани с помощта на еднопосочен ANOVA Бяха тествани множество сравнения, използвайки защитен или незащитен LSD тест на Fisher. Изкривените данни бяха трансформирани в дневника преди статистическия анализ.

Благодаря

Тази работа беше подкрепена от стратегическо партньорство на шотландското правителство за науката и аналитичните услуги в областта на науката и аналитичните услуги. Също така признаваме подкрепата на изчислителния клъстер Максуел, финансиран от Университета в Абърдийн. Благодарим на Гил Кембъл за провеждането на микрочиповия анализ, Дона Хендерсън за анализ на чернодробните мазнини (Институт Ровет, Университет в Абърдийн) и Пит Хедли (Институт Джеймс Хътън, Дънди), за сканиране на масивите Agilent.

Електронен допълнителен материал

Допълнителна информация

Допълнителен набор от данни

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.