елементи

Тази статия е актуализирана

абстрактно

Затлъстяването е достигнало глобални епидемични размери и най-малко 2,8 милиона души умират всяка година от наднормено тегло или затлъстяване (СЗО). Затлъстяването също е основен рисков фактор за инсулинова резистентност, сърдечно-съдови заболявания и диабет тип 2 (T2D) 1. Пациентите с T2D обикновено са хипергликемични и страдат от усложнения като хипертония, инсулт, атеросклероза и рак 2. Стратегии, които намаляват затлъстяването, обещават да намалят смъртността и да подобрят качеството на живот на засегнатите лица.

Ние показахме, че системното приложение на билирубин повишава инсулиновата чувствителност чрез потискане на ER стреса и възпалението при DIO мишки 35. Сега разширихме тези наблюдения, за да изследваме дали билирубинът регулира липидния метаболизъм, както се наблюдава при пациенти с болест на Gilbert 34, и дали билирубинът регулира серумните нива на адипокин при DIO мишки. Също така оценихме дългосрочните ефекти на лечението с билирубин върху липидния метаболизъм и нивата на адипокин 7 седмици след прекратяване на лечението с билирубин.

резултатът

Прилагането на билирубин намалява телесното тегло и подобрява инсулиновата резистентност при DIO мишки

Маса в пълен размер

билирубин

( а ) Промени в телесното тегло на DIO мишки, лекувани с билирубин (DIO + BR) или носител (DIO + V) в сравнение с контролните мишки, хранени със стандартна диета (CHOW). ( б ) Ежедневни нива на кръвната захар на гладно при DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки по време на лечението с билирубин. ( ° С ) Среден 24-часов прием на храна на мишка при DIO мишки, получаващи BR или носител. ( д ) Тест за интраперитонеална глюкозна толерантност (GTT) при DIO и CHOW мишки преди лечение с билирубин; д ) площ под кривата GTT. ( е ) Тест за инсулинова толерантност (ITT) на DIO мишки и CHOW мишки преди лечение с билирубин; ( ж ) обърнатата област под базовата линия над кривата. ( з ) GTT мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW 14 дни след първата инжекция с билирубин; i ) площ под кривата. ( j ) ITT мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW 14 дни след първата инжекция с билирубин; ( к ) обърнете областта под базовата линия над кривата. Във всяка група бяха включени поне 6 до 8 мишки; ** стр

а ) Чернодробни тежести на мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW. ( б ) Епидидимални мазнини в DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки. ( ° С ) фракции в областта на торбичката в черния дроб на мишки DIO + BR, DIO + V или CHOW. ( д ) Диаметри на мастните мехурчета (μm) на епидидимални адипоцити DIO + BR, DIO + V или CHOW. ( д ) Представителни микрофотографии на H&E оцветяване на чернодробни секции и мастна тъкан от мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW. Скала = 200 μm. Най-малко 3 мишки бяха анализирани във всяка група; * стр

TC серумни нива ( а ), LDL ( б ), HDL ( ° С ), TG ( д ), лептин ( д ), адипонектин ( е ), общ билирубин ж ) и директен билирубин ( з ) при DIO + BR, DIO + V или CHOW мишки бяха измерени в серум веднага след прекратяване на лечението с билирубин. Всяка група съдържа 3-4 мишки; Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

Относителна експресия на mRNA на инсулиновия рецептор (Insr) ( а ), SREBP-1 ( б ), Fasn ( ° С ) и ACC ( д ) в черния дроб на DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки, измерени чрез RT-PCR анализ Стойностите представляват относителната експресия на целевия ген в сравнение с експресията на ендогенния контрол. ( д ) Експресия на PPARy и C/EBPa протеин, определен в черния дроб от DIO + BR, DIO + V и CHOW мишки чрез Western blot анализ. Геловете се извършват при същите експериментални условия и се показват подрязани петна. ( е ) Относителна експресия на PPARγ протеин и ( ж ) C/EBPa по отношение на контрола на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназата (GAPDH) (софтуер NIH ImageJ). Анализирани са проби от 3 отделни мишки. Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

( а ) Телесно тегло на мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW по време на 9-седмичния експеримент. ( б ) Серумни нива на глюкоза при мишки DIO + BR, DIO + V и CHOW по време на 9-седмичния експеримент. Черен дроб ( ° С ) и епидидимални мастни маси ( д ), измерена 7 седмици след края на лечението. ( д ) (вляво) GTT DIO мишки, измерени 7 седмици след завършване на лечението; (вдясно) стойности на площта под кривата над базовата линия; ( е ) (вляво) ITT DIO мишки, измерени 7 седмици след завършване на лечението; (вдясно) стойности на обратната област над кривата под базовата линия. Във всяка група бяха включени поне 3 мишки. Данните са средни ± стандартно отклонение; *** стр

Най-важното откритие на това проучване е, че лечението с билирубин намалява общите нива на холестерола при DIO мишки. Намалението може да се дължи на промени както в нивата на HDL, така и на LDL, въпреки че намаляването на тези елементи не достига статистическа значимост. Тези открития са в съответствие с наблюденията при лица със синдром на Gilbert, при които леко повишени нива на билирубин са свързани с намалени нива на общия холестерол, LDL и триглицериди и са свързани с намален провъзпалителен статус и намалена експозиция на окислителни условия 38, 39. Въпреки че не се наблюдава промяна в нивата на триглицеридите при лекувани с билирубин мишки 14 дни след лечението с билирубин, се наблюдава намаление 7 седмици след лечението, което предполага, че ефектът на билирубина върху нивата на триглицеридите може да се забави. Нашето проучване предостави доказателства, че екзогенно прилаганият билирубин е свързан с променен липиден профил при затлъстели мишки.

Установихме, че приложението на билирубин значително намалява нивата на лептин при DIO мишки. Приемът на храна при лекувани с билирубин DIO мишки изглежда не е фактор по време на лечението с билирубин и не се наблюдава разлика в приема на храна след прекратяване на лечението. Намаляването на нивата на лептин при мишки, лекувани с билирубин, може да се дължи на намаляване на мастната тъкан, което се подкрепя от намалена експресия на SREBP-1. Другите две наблюдения са от значение: известно е, че лептинът увеличава възпалението чрез регулиране на TNF-α 40, а лечението с билирубин намалява експресията на TNF-α при DIO мишки 35. Следователно е разумно да се предположи, че ефектите на билирубина върху затлъстяването се дължат на променен липиден синтез, намалени нива на лептин и намалено производство на TNF-α. Клиничното значение на билирубина трябва да бъде изследвано като потенциално лечение за намаляване на липидния синтез, както се предполага от проучвания при хора 34 .

Както също се съобщава от други изследователи 43, 44, ние открихме, че DIO мишките показват по-високи нива на общ и директен билирубин от контролите на Chow или DIO мишки, лекувани с екзогенен билирубин. Повишеният билирубин при DIO животни може да отразява блокиране на секрецията на билирубин поради нарушена чернодробна функция при тези мишки. Едно от възможните обяснения за намаляването на нивата на билирубин при лекувани с билирубин DIO мишки е, че намаляването може да се дължи на способността на екзогенния билирубин да регулира P450. P450s са суперсемейство от хемосъдържащи монооксигеназни ензими, които метаболизират разнообразна гама от съединения както от ендогенен, така и от екзогенен произход. Проучванията показват, че две различни изоформи на P450, CTP1A1 и CYP1A2, медиират алтернативен път на разграждане на билирубина 45, 46, 47. В допълнение, билирубинът може директно да регулира ензимната активност на CYP1A1 по зависим от арил въглехидратен рецептор 48 начин, като по този начин стимулира секрецията на билирубин. По този начин изглежда възможно този механизъм да подобри секрецията на билирубин (и по този начин да намали нивата на билирубин в сравнение само с DIO) при нашите DIO мишки, лекувани с екзогенен билирубин. За проверка на тази хипотеза ще са необходими по-нататъшни проучвания извън настоящия ръкопис.

В това проучване установихме, че краткосрочното лечение с билирубин е свързано с намаляване на общия холестерол и увеличаване на PPARy и адипокини. Тези открития предоставят механистични доказателства, че билирубинът или промененият метаболизъм на билирубина (например частични инхибитори на UGT1A1 49) могат да бъдат полезни като терапевтичен подход за намаляване на затлъстяването и подобряване на инсулиновата резистентност и глюкозния толеранс.

методи

Мъжки мишки C57BL/6 (на 6 седмици) са закупени от Института по генетика и биология на развитието към Китайската академия на науките (Пекин, Китай). Мишките са били хранени или с диета с високо съдържание на мазнини (таблица 1), или със стандартна диета CHOW-мазнини (10% калории от мазнини) в продължение на 24 седмици преди лечението. Комитетът за грижа за животните от Циндаоския земеделски университет одобри всички експерименти с животни. Методите са извършени в съответствие с одобрените насоки.

Приготвяне и приложение на билирубин

Билирубин (Frontier Scientific, Logan, UT) се разтваря в 0,1 N NaOH и рН се регулира до 7,4 с HCI. Билирубин се прилага интраперитонеално при 20 μmol/kg (11,7 mg/kg) два пъти дневно в продължение на 14 дни. Контролните мишки DIO или CHOW получиха носител в същия режим на инжектиране.

Мониторинг на мишки след лечение

Нивата на кръвната захар на гладно и телесното тегло на мишките се измерват ежедневно в 9:00 сутринта. Капка пълна кръв (приблизително 5-10 μl) беше взета от минимална част на опашката от края на мишката опашка и анализирана с помощта на глюкометър Sannuo (San Nuo Inc., Changsha, China). Физическата активност на мишки (включително поведение, прием на храна, пиене и облизване) се наблюдава ежедневно, както е описано в раздел 35. Приемът на храна (без разлив) се измерва в продължение на 24 часа 7 дни след лечението и седмично в продължение на 7 седмици след лечението с билирубин.

Интраперитонеален глюкозен толеранс (IPGTT) и инсулинов толеранс (ITT)

За IPGTT, мишките се гладуват цяла нощ и след това се инжектират с 2 g/kg глюкозен разтвор (ip). За ITT мишките бяха на гладно в продължение на 5 часа и след това се инжектираха с 0.75 U/kg инсулин (ip; Eli Lili, Indianapolis, IN). Нивата на серумна глюкоза се измерват на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектиране на глюкоза или инсулин.

Събиране на тъкани, приготвяне на серум и биохимия на кръвта

В края на всеки експеримент мишките се анестезират и кръвта се събира чрез ретроорбитално кървене в хепаринизирана тръба. Плазмата се получава чрез центрофугиране и се съхранява при -80 ° С за допълнителен анализ. След това мишките се умъртвяват и черният дроб и епидидималната мастна тъкан се разделят, претеглят и замразяват бързо в течен азот за по-късен анализ. Нивата на серумен TC, TG, HDL, LDL и билирубин бяха измервани с помощта на специфични комплекти реактиви (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Нивата на лептин, инсулин и адипонектин са измерени чрез ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Анализ в реално време (RT) -PCR

Експресията на инсулинов рецептор, лептинов рецептор, аполипопротеин A-IV (Apoa4) и SREBP-1 в черния дроб се определя количествено чрез RT-PCR анализ, както е описано по-горе 50. Експресията на актин β се определя количествено чрез RT-PCR във всяка проба и се използва като ендогенен контрол. RT-PCR грундове в реално време са закупени от Life Technologies (Invitrogen Trading Co., Ltd., Шанхай, Китай).

Western blot анализ

Съдържанието на протеин в цели клетъчни лизати се определя количествено чрез BCA анализ и 30 μg протеин от всяка проба се отделя върху 4-12% Bis-Tris гел (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China). Протеините бяха прехвърлени в мембрана Hybond-P (GE health, Piscataway, NJ), блокирани с 5% обезмаслено мляко и инкубирани със следните първични антитела: PPARγ, C/EBPa (Abcam, САЩ) и GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc., САЩ), в продължение на една нощ при 4 ° С. След това петна се изследват с маркирани с пероксидаза от хрян вторични антитела (Sangon Biotech Ltd., Шанхай, Китай) в продължение на 45 минути при стайна температура и се визуализират с помощта на ECL комплект за откриване (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Великобритания). Силата на всеки сигнал се определя с помощта на софтуера Image J (NIH).

Оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E)

Имунохистохимията на миши черен дроб и епидидимална мазнина се извършва, както е описано 35. Накратко, части от черен дроб или мастна тъкан бяха фиксирани за една нощ в 10% буфериран формалин, вградени в парафин и разделени. Слайдовете се потапят във филтриран хематоксилин за 6 минути, изплакват се с вода и се оцветяват с еозин за още 1-2 минути. Секциите се изплакват с вода и се дехидратират в нарастващи алкохолни разтвори, почистват се с ксилол и се поставят с покривно стъкло върху етикетираното стъкло. Слайдовете бяха изследвани под микроскоп Olympus BX51 с двойна употреба (Olympus, Токио, Япония) и изображенията бяха заснети с цифров фотоапарат Olympus DP72. Площта на ваксината в общата площ на чернодробната тъкан се определя в черния дроб с аналитичен софтуер Image-Pro Plus. Индивидуалните средни стойности на мастните клетки (n = 75 във всяка група) бяха измерени с помощта на софтуера CellSens Standard (Olympus).

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SD. Разликите между двете групи бяха сравнени за статистическа значимост, използвайки несдвоени t-тестове на Student с корекция на Bonferroni. Разликите се смятаха за значими, когато p