foxp1

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • Материали и методи
  • Клинично секвениране на екзома
  • Клетъчна култура и трансфекция
  • Екстракция на РНК и синтез на cDNA
  • Разпадане, медиирано от глупости
  • Количествена RT-PCR
  • ДНК експресионни конструкции и насочена към сайта мутагенеза
  • SDS-PAGE и уестърн блотинг
  • Флуоресцентна микроскопия
  • Анализи за репортер на луцифераза
  • Биолуминесцентен резонансен трансфер на енергия (BRET)
  • Статистическа значимост
  • резултатът
  • Клиничен фенотип
  • Ново вариант вариант на FOXP1, идентифициран чрез екзома секвениране
  • Функционална характеристика на вариант на последователност FOXP1 в човешките клетки
  • дискусия
  • стъпки
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Допълнителна фигура 2

елементи

  • Функционална геномика
  • Генетика на нервната система
  • Нарушения на неврологичното развитие
  • Последователност от ново поколение

абстрактно

FOXP1 (протеин на предната кутия P1) е транскрипционен фактор, който участва в развитието на няколко тъкани, включително мозъка. Възникващият фенотип на пациенти с нарушаващи протеина варианти на FOXP1 включва глобално забавяне на развитието, умствено увреждане и лек до тежък дефицит на говор/език. Говорим за дете с анамнеза за тежка хипотония, разстройство от аутистичния спектър и леко умствено увреждане с тежко говорно/езиково увреждане. Клиничното секвениране на екзома идентифицира хетерозиготен de novo вариант на FOXP1 c.1267_1268delGT (p.V423Hfs * 37). Функционалните анализи, използващи клетъчни модели, показват, че вариантът нарушава няколко аспекта на активността на FOXP1, включително субклетъчна локализация и транскрипционни репресивни свойства. Нашите открития сочат важността на извършването на функционална характеристика, за да се разкрие биологичното значение на вариантите, идентифицирани чрез геномни подходи, като по този начин се дава представа за пътищата, лежащи в основата на сложните невроразвиващи разстройства. В допълнение, нашите данни подкрепят хипотезата, че de novo вариантите представляват значителни причинно-следствени фактори при тежки спорадични разстройства и разширяват фенотипа, наблюдаван при индивиди с FOXP1 хаплоинсуфициентност.

FOXP1 (P1 виличен протеин; OMIM 605515) принадлежи към семейството гени на протеин на транскрипционен фактор FOX, дефинирано от наличието на характерен ДНК свързващ домен, известен като разклонителна кутия (FOX). 1 Ортологът на мишката, Foxp1, е необходим за нормалното развитие на сърцето, белите дробове и хранопровода 2, 3 и действа като допълнение към транскрипционните фактори на Hox при регулиране на проекцията и прикрепването на моторните неврони към целевите мускули. 4, 5 Значението на Foxp1 в развитието на невроните се подчертава от проучвания върху мишки със специфично за мозъка делеция на Foxp1. 6 Тези мутантни мишки показват нарушено развитие на невроните и аутистично поведение. През последните години се съобщават варианти на FOXP1 при много пациенти със спектрални разстройства на спорадичен аутизъм (ASD), умствени увреждания (ID), глобално забавяне на развитието и умерено до тежко забавяне на говора, където експресивната реч е най-засегната (OMIM 613670)., 7, 8 Наличието на говорни и езикови нарушения като характеристика на синдрома на недостатъчност на FOXP1 е интересно, тъй като най-сходният ген за FOXP1 е FOXP2, който се нарушава при рядката форма на говорни и езикови нарушения (OMIM: ген 605317, разстройство 602081 ).,

Вариантите на FOXP1, идентифицирани при пациенти с ASD и/или ID, включват делеции на цели гени, 7, 9, 10, 11, 12 транслокации, 13 безсмислени варианта, 14 варианта на миссенс 15 и варианти на рамкова смяна. 16 Идентифицирането на делеции на целия ген предполага, че механизмът на патогенност е хаплоинсуфицирането. Тежестта на фенотипа предполага, че тези мутации не могат да бъдат наследени и във всички случаи, когато е тествана родителска ДНК, се установява, че се появяват варианти de novo. Използвайки секвениране от следващо поколение, ние идентифицирахме и охарактеризирахме de novo варианти на FOXP1 при момиче с анамнеза за тежка хипотония, ASD и лек ID с тежки дефицити на реч/език в това проучване.

Материали и методи

Клинично секвениране на екзома

Клинично секвениране на екзома на пробанда и неговите незасегнати родители се извършва в Центъра за клинична геномика на UCLA (за подробно описание на клиничния екзомен тръбопровод на UCLA вижте Lee et al 17). Само един висококачествен несинонимен вариант на ново кодиране, който засяга гена FOXP1, е идентифициран при пациент. Този вариант на последователност има качествен рейтинг ≥ 500, без показания, подкрепящи алтернативния алел при родителите, и никога не е наблюдаван сред общата популация (въз основа на проекта 1k Genomes Project, dbSNP135, NHLBI ESP). Не са идентифицирани клинично значими наследствени хомозиготни, хемизиготни, хомоплазмени или комбинирани хетерозиготни варианти при пациента.

Клетъчна култура и трансфекция

Живите лимфобластни клетки, трансформирани с вируса на Epstein-Barr, са получени от баща, майка, пробанд и един незасегнат брат или сестра. Култури се отглеждат в RPMI-1640 (Lonza, Verviers, Белгия), допълнена с 10% фетален говежди серум (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). HEK293 клетки се отглеждат в DMEM и SHSY5Y в DMEM-F12 (Invitrogen). Средата беше допълнена с 10% фетален говежди серум (Invitrogen). Трансфекциите бяха извършени с помощта на GeneJuice в съответствие с инструкциите на производителя (Merck-Millipore, Амстердам, Холандия).

Екстракция на РНК и синтез на cDNA

Обща РНК се извлича от обезсмъртени лимфобласти с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Холандия) и се образува първоверижна cDNA, използвайки комплект с обратна транскрипция на cDNA с висока производителност (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA).

Разпадане, медиирано от глупости

Разпространението, опосредствано от глупости (NMD), беше оценено, както е описано по-горе. 16 FOXP1 сДНК се амплифицира чрез PCR, използвайки праймери 5'-GTCTACAGAACCCAAAGCCGC-3 'и обратни 5'-GGTTCTGCGCAATATCTGCTG-3' праймери, последвани от последователност на Sanger.

Количествена RT-PCR

Количествената RT-PCR е извършена и анализирана, както е описано по-рано 18, като се използват праймери, специфични за амплификация на FOXP1 c.1267_1268delGT (5'-CGTCACCCAAGGCCCCTCTC-3 '; 5'-TTGCGTCGGAAGTAAGCAAAC-3', последвано от последователност на Sanger.

ДНК експресионни конструкции и насочена към сайта мутагенеза

Wildtype (WT) FOXP1 и FOXP2 се амплифицират чрез PCR и се клонират в pCR2.1-TOPO (Invitrogen). 19 Вариант p.V423Hfs * 37 FOXP1 е генериран с помощта на pCR2.1-TOPO.FOXP1 като шаблон с комплект за мутагенеза QuikChange II Site-Direct (Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) и 5'-TGGTGGTTGTGATGAGAGGGGGGGG-3 'обратен 5'-CCCAAGGCCCCTCTCATCACAACCACCA-3 'грундове. КДНК на FOXP бяха субклонирани с използване на рестрикционни сайтове на BamHI/Xba I в pcDNA4HisMax, модифициран вектор pmCherry-C1 (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Франция), както и pLuc и pYFP експресионни вектори. Всички конструкции бяха проверени чрез последователност на Sanger.

SDS-PAGE и уестърн блотинг

Клетките HEK293 бяха трансфектирани с еквимоларни концентрации на експресионни плазмиди FOXP1 и култивирани в продължение на 48 часа. Лизисът на клетките, SDS-PAGE и Western blotting се извършват, както е описано по-горе. 19 мембрани бяха изследвани с мишка Clontech anti-EGFP (за pYFP конструкции) за една нощ при 4 ° С, последвана от инкубация с конюгиран с HRP кози анти-миши IgG в продължение на 45 минути при стайна температура (Bio-Rad, Veenendaal, Холандия). Петната бяха събрани и тествани повторно със Sigma анти-β-актин антитяло, за да се потвърди същото зареждане с протеин.

Флуоресцентна микроскопия

Клетките HEK293 и SHSY5Y бяха фиксирани върху покривно стъкло, както беше описано по-горе. 19 YFP и mCherry слети протеини бяха визуализирани чрез директна флуоресценция и ядрата бяха визуализирани с помощта на Hoescht 33342 (Invitrogen). Флуоресцентни изображения са получени с помощта на флуоресцентен микроскоп Axiovert A-1 със софтуер ZEN Image (Zeiss, Oberkochen, Германия).

Анализи за репортер на луцифераза

Анализите на луцифераза се извършват, както е описано по-горе. 19.

Биолуминесцентен резонансен трансфер на енергия (BRET)

BRET анализите се извършват, както е описано по-горе. 19, 20

Статистическа значимост

Статистическата значимост на луциферазния репортерен анализ беше анализирана с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ и post hoc анализ на Tukey.

резултатът

Клиничен фенотип

Пациентът е четиринадесетгодишна жена, първородено дете на родители без конвулсии. Майка й беше на 30 години, а баща й на 32 години. Тя е родена в кесарево сечение поради олигохидрамнион и прееклампсия и е установено, че има двойна мембрана пъпна връв и тежка хипотония при раждането. През първата година тя имаше тежки двигателни закъснения; тя започна да пълзи на 12 месеца и да ходи на 20 месеца. Пациентът също имаше забавена реч, първите думи започнаха след 20 месеца. На 3-годишна възраст е диагностицирана с експресивно и рецептивно разстройство на комуникацията.

В момента само 50% от речта на пациента е последователна и не може да поддържа разговора. По-конкретно, нейната реч няма структура, има ограничено съдържание и разпространение и повтаря прости фрази (ехолалия). Предпочитаният метод за комуникация е изпращането на съобщения чрез електронно устройство. Пациентът е направил лоша оценка на езика: 50 точки за цялостна оценка на говоримия език (

Изображение в пълен размер

Изследването с нормални резултати включва генетично изследване за мускулна дистрофия, митохондриални нарушения, синдром на крехък X и микрочипове SNP. Електроенцефалографията и изследванията на нервната проводимост бяха нормални. Ядрено-магнитен резонанс, направен на 12-годишна възраст, разкрива по-неинтензифициращи се аномалии на подкорковата и дълбоката бяла материя и случайно откриване на венозен ангиом в левия преден лоб.

De novo вариант на FOXP1 последователността, идентифициран чрез екзома секвениране

В редки случаи на ASD, последните подходи за откриване на гени се фокусират върху идентифицирането на de novo варианти чрез използване на секвениране на пълната екзома в трио родител-дете. Тази стратегия е успешна при идентифицирането на значителна част от популационния риск и при идентифицирането на вариации, причиняващи относително по-големи биологични ефекти. 21 За да идентифицираме предполагаеми варианти, които могат да повлияят на протеиновата функция, ние извършихме клинично секвениране на екзома на 17 върху ДНК от пробанди и техните родители, без да го засягаме. Използвайки този подход, идентифицирахме хетерозиготна de novo двубазна делеция в FOXP1, присъстваща в пробанда, която впоследствие беше потвърдена и потвърдена като de novo чрез секвениране на Sanger (Фигура 1b). Вариантът FOXP1 е подаден в базата данни на NCBI ClinVar (//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/; номер за присъединяване към ClinVar SCV000189225).

Този вариант, c.1267_1268delGT (номериран от първия кодиращ нуклеотид в NM_032682.5), се намира в екзон 15 на FOXP1 (номериран от NG_028243.1). Очаква се промяната да въведе рамково изместване в кодирания протеин, което води до преждевременно прекратяване и загуба на ДНК-свързващия домейн и сигналите за локализация на ядрата (NLS) (p.V423Hfs * 37, както се препоръчва от HGVS) (Фигура 1в). В миналото са докладвани два потенциално причинителни хетерозиготни de novo пресечени варианта на FOXP1 в случаи на ASD (c.1014_1015insA (p.A339Sfs * 4)) и ID (c.1573C> T (p.R525 *)) с реч и езикови дефицити 14 16 (вижте фигура 1в за сравнение между трите пресечени варианта на FOXP1 протеин).

Тъй като вариантът въвежда стоп кодон преди крайната граница на екзон във FOXP1, мутантният транскрипт може да претърпи NMD. Следователно, ние оценихме експресията на FOXP1 транскрипти в лимфобласти, получени от пробанди. При нормални условия на клетъчна култура се установява, че се експресира само алелът WT (Фигура 1г). След инхибиране на NMD може да бъде открита експресия както на варианта, така и на WT алелите, което предполага, че вариантите на транскриптите обикновено се влошават от NMD (Фигура 1d). За да определим дали някой от вариантните транскрипти е избегнал този процес, извършихме количествена RT-PCR с праймери, специфични за алела на варианта FOXP1 и установихме, че c.1267_1268delGT FOXP1 се експресира при ниски нива в лимфобластите, получени от пробанди (Фигура 1д и допълнителна снимка 1 ).

Функционална характеристика на варианта на FOXP1 последователност в човешки клетки

За да изследваме ефектите на варианти на NMD-избягващи транскрипти, извършихме функционална характеристика на протеина, кодиран от мутиралия транскрипт. WT и вариантните форми на FOXP1 се експресират като YFP- или mCherry-слети протеини в клетки HEK293. Вариантът на протеин p.V423Hfs * 37 се експресира на сходно ниво с WT протеина, определено чрез Western blotting (Фигура 2а). За разлика от FOXP1, който се локализира в ядрото, вариантът p.V423Hfs * 37 се слива с mCherry, локализиран в цитоплазмата, в съответствие със загубата на двата ядрени локализационни сигнала (Фигура 2b). Трябва да се отбележи, че когато p.V423Hfs * 37 вариантът се е слял с YFP, той образува агрегати в цитоплазмата (Допълнителна фигура 2). Подобни резултати бяха получени чрез изследване на субклетъчната локализация на варианта FOXP1 в трансфектирани човешки SHSY5Y невробластомни клетки (Допълнителна фигура 3). Липсата на FOX ДНК-свързващ домен предполага, че вариантът FOXP1 е малко вероятно да запази способността си да свързва ДНК. Анализите с репортер на луцифераза демонстрират, че вариантът p.V423Hfs * 37 не е в състояние да потисне транскрипцията, в съответствие със загуба на способността за свързване на ДНК (Фигура 2в).

дискусия

Тук представяме пациент с de novo 2-bp делеция във FOXP1. Тази промяна води до влошаване на варианта на транскриптите и кодира нефункционален протеин, което предполага, че фенотипът на пациента вероятно е резултат от FOXP1 хаплоинергия. Освен това демонстрираме, че подмножество от транскрипти на вариант FOXP1 избягват NMD и извънклетъчните WT секвестранти FOXP1 и FOXP2, предполагайки, че вариантът p.V423Hfs * 37 може да има доминиращ отрицателен ефект при транслацията. В този случай биологичните ефекти се дължат на комбинация от механизми, като основният патологичен механизъм е хаплоинформацията. Бъдещите проучвания за нокдаун на FOXP1 (напр. Използване на shRNA конструкции) трябва да бъдат информативни при оценката на ефектите на FOXP1 хаплоинсуфициентността на молекулярно ниво.

Нашият пациент споделя няколко фенотипни характеристики с други индивиди, които носят варианти на FOXP1, които нарушават протеиновата функция, включително аутизъм, идентификация, тежки езикови дефицити и макроцефалия. 7 Тези наблюдения предполагат, че FOXP1 хаплоинсуфицирането води до отчетлив синдром, който включва аспекти на ID и ASD, както и други клинични симптоми. 7 Следователно целевият скрининг за варианти на FOXP1 е оправдан при пробанди с клинични характеристики, съответстващи на синдрома.

Въпреки че речта и езикът са били засегнати при нашата пациентка, тя не е имала детска речева апраксия (трудности при координирането на сложните последователности на движенията на орофациалните мускули, необходими за речта), и това е най-важната характеристика в случаите на патогенни FOXP2 мутации. 26, 27 При индивиди с варианти на FOXP2 проблемите с речевата артикулация са придружени от нарушения в няколко аспекта на изразителен и възприятен език. 28, 29 При нашия пациент по-изразеният език е бил по-значително засегнат от рецептивния език, в съответствие с фенотипите, наблюдавани при други индивиди с варианти на загуба на функция на FOXP1. 7, 11, 14 Досега не са наблюдавани варианти на FOXP1, които да причиняват езиково увреждане при липса на по-глобална когнитивна дисфункция. 30 Наблюдаваните разлики между FOXP1 и FOXP2 хаплоинергичните фенотипове могат да отразяват различията в невронните експресионни модели 23, 24 и/или регулирането на споделени и несподелени цели надолу по веригата.

Нашето разследване предоставя допълнителни доказателства, че значителна част от тежките изолирани нарушения на невроразвитието може да са резултат от de novo варианти. Това проучване допълнително подчертава значението на експерименталното характеризиране на варианти, открити чрез секвениране на ДНК от следващо поколение, за разбиране на молекулярните и клетъчните мрежи, които са основни за основните нарушения на неврологичното развитие.