сравнително

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Точно мултиплексно количествено определяне на модификацията на РНК от А до I в човешкия мозък
  • Висок динамичен диапазон на редактиране на сайтове и лица
  • Модели на редактиране в глутаматергичната и серотонергичната система
  • Диференциално относително използване изоформи ADARB1 при лица с ASD
  • Тясна връзка между кодирането и сплайсинга в трите AMPA и филамин-А рецептора
  • Цис а транс взаимоотношения между сайтове за редактиране
  • дискусия
  • Наличност на данни
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

елементи

  • Епигенетика в нервната система
  • Редактиране на РНК

абстрактно

Преобразуванията на специфични за базата аденозин-инозинови (A-to-I) РНК, извършени от ензима РНК ензим аденозин дезаминаза (ADAR), показват точна регионална специфичност в мозъка и модулират сложното поведение в моделните организми. 1, 2, 3 редактирането на РНК от А до I е ефективно средство за увеличаване на сложността на РНК и по този начин за фина настройка на генната функция и дозиране. 4, 5, 6 Клетъчните механизми разпознават инозина като гуанозин, така че A-to-I кодонът за редактиране и сплайсинг сигнали директно модифицират функцията на гени, кодиращи протеина, 6, 7, 8, 9, 10, 11, докато microRNA редактиране 12, 13, 14 и техните свързващи места 15 променят генната експресия. Това е особено важно за човешкия мозък, единственият най-сложен орган на клетъчното разнообразие, свързаност, морфогенеза и отговорите на стимулите от околната среда. 16.

Малко се знае за редактирането на РНК от А до I при хората, но се смята, че това е един от молекулярните механизми, свързващи входа на околната среда и поведенческите резултати. 18, 25 Повишено редактиране при хора 26 в сравнение с други животни, 27 включително примати, които не са хора, 28 е проектирано да предизвика молекулярна сложност, която може да формира основата на знанията от по-висок ред. 18 Следователно, характеризирането на A-I редактирането при типично и нетипично развити индивиди може да хвърли светлина върху зависимите от околната среда епигенетични механизми, които са от основно значение за човешкото невронално развитие.

Разстройствата от аутистичния спектър (ASD; MIM 209850) са силно наследени често срещани невроразвитие със сложна генетична етиология, характеризиращи се с дефицити в реципрочно социално взаимодействие и повтарящо се поведение. 29 Няколко проучвания характеризират синаптични аномалии при ASD. 29, 30, 31, 32 Механизмите на взаимодействията между гените и околната среда и приносът им към наблюдаваните синаптични промени все още са неизвестни. Броят на кандидат-гените се увеличава бързо с 33, 34, 35 и основното предизвикателство е да се идентифицира контекстът, в който те представляват риск за ASD. Последните проучвания на близнаци предполагат, че приносът на факторите на околната среда към ASD е по-голям, отколкото се е смятало първоначално, с по-ниски оценки на монозиготното съгласие (77–88%) и изненадващо високото дизиготно съгласие от 31% (в сравнение с рецидив на братя и сестри от 19%) . ). 36, 37 Следователно, идентифицирането на механизми, които управляват взаимодействията между гените и околната среда, свързани с ASD, може да бъде информативно за оценка на риска. 38 РНК-редактирането от А до I е потенциално един такъв механизъм, който съчетава стимулите на околната среда със синаптичното предаване.

Няколко доказателствени реда подкрепят изследването на връзката между корекциите A-to-I и ASD. Първо, моделните организми с променено редактиране на AII показват неадаптивно поведение, характерно за ASD, 2, 39, понякога с припадъци 1, 40 или симптоми на Prader-Willi, 41 от които обикновено се срещат при 25% от децата с ASD., 42, 43 Второ, променено редактиране на серотониновия рецептор HTR2C е установено в миши модел на аутизъм 44 и при разстройства, които се събират в семейства с ASD, 45 включително шизофрения 46 и тежка депресия. На трето място, наскоро беше показано, че летящият модел на синдром на чуплив X, най-често срещаната единична генна причина за ASD 48, показва значителни модификации в модификациите чрез директно взаимодействие между гена Fragile X dFMR1 и ензима за редактиране на dADAR. 49 И накрая, независимите геномни изследвания включват замесени варианти на синаптичните гени, които са най-редактираните гени, 17 като повтаряща се тема в ASD. 29, 30, 31, 32

Тук се фокусираме върху невроразвиващо регулирано редактиране A-to-I, което директно променя синаптичната функция. Ние точно определяме количествено и сравняваме нивата на редактиране между индивидите и характеризираме различни страни за редактиране на 10 синаптични гена, действащи в човешкия мозък, контрастирайки мозъка след смъртта от типично развити индивиди с мозък, изолиран от индивиди с ASD. След това (i) изследваме конкретно модели на модификации в глутаматергичните и серотонинергичните системи, (ii) корелираме модификациите с помощта на изоформи и (iii) идентифицираме клъстери на корелирани сайтове. Важно е, че открихме, че относителната употреба на нефункционалната форма на редактиращия ензим ADARB1 е значително по-висока при ASD.

резултатът

Точно мултиплексно количествено определяне на модификацията на РНК от А до I в човешкия мозък

Този подход предостави набор от данни с висока надеждност на редактиране на синаптична РНК от А до I от лица с ASD и съответни невротипични индивиди със средна дължина на доверителен интервал 95% (CI) 0,0338. За независимо валидиране бяха анализирани същите cDNA и gDNA чрез паралелно улавяне и последователност.> 3000 × Illumina на шест места сред всички индивиди (допълнителна информация). Тясна корелация между двата метода за откриване на корекция е показана на допълнителна фигура 4 и допълнителна таблица 4 със среден коефициент на корелация 0,923.

Висок динамичен диапазон на редактиране на сайтове и лица

Нивата на корекция на 25 места бяха измервани стабилно и беше установено, че варират от 2,5 до 99,6% (Фигура 1а и Допълнителна Фигура 5). Установено е неочаквано широко разпределение на нивата на приспособяване сред невротипични индивиди и внимателно съчетани индивиди с ASD на тези места, за които по-рано е показано, че са невродеволюционни при 23 мишки (среден коефициент на вариация (CV) 54,8%). Само един сайт, GRIA2 Q/R, показва сходни нива на корекции за всички лица (CV = 0,5%), в съответствие с докладите, че корекциите на този сайт са необходими и непроменени по време на разработката. 23, 65 Не са открити връзки между нивата на приспособяване и възрастта, пола, расата, следкланичния интервал или целостта на РНК (допълнителна фигура 6).

Лица с ASD в екстремно разпределение на разпределението на населението в 20 от 25 населени места. ( а ) Висок динамичен диапазон на средните корекции в сайтовете, от 99,6% под границата на откриване. Колоните Sd, показани в лилаво, показват голяма вариативност в невроразвиващо регулираното редактиране между внимателно сдвоени лица. б ) Индивидуалният SD от средното ниво на корекции във всички населени места показва, че крайностите на разпределението на корекциите на популацията обикновено са индивиди с ASD (оранжеви триъгълници) и допринасят за голямата вариабилност, спомената в а ). Хоризонталните линии показват стандартизирано 95% CI разпределение на индивидуалното задно издание. Нивата на синаптична корекция най-малко две sd от средната стойност са силно информативни за ASD с положителна прогнозна стойност от 78%.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

При проверка на индивидуалната плътност на корекция на гърба във всички населени места (допълнителна фигура 5), забелязахме, че крайностите на повечето разпределения на лечението са лица с ASD. За количествено определяне на това наблюдение, точковите оценки на нивата на корекция на всеки индивид на всеки обект са трансформирани в Z оценка и тези 2 или  - 2 се считат за екстремни, представляващи нива на корекция, които са най-малко два sd от средното. На 20 от 25-те места индивидите с ASD са били в екстремния спектър от модификации, наблюдавани за този сайт (Фигура 1b). Наличието на екстремни нива на синаптично редактиране е много информативно за ASD, с положителна прогнозна стойност на p (ASD || Z редактиране |> 2) 0, 78. Отклоненията на различни места са различни индивиди с ASD (допълнителни фигури 5 и 7) и корекциите на повече от три sd от средното бяха специфични за лица с ASD (допълнителна фигура 7). Общата редакционна дисперсия при ASD е повече от удвоена в сравнение с невротипните индивиди (ASD вариация = 0,58, средна невротипична вариация на еднакво големи подгрупи = 0,24, Brown - Forsythe P = 5, 6e - 3). Основният принос за тази увеличена дисперсия са 30% от хората с ASD (допълнителна фигура 8).

Модели на редактиране в глутаматергичната и серотонергичната система

Освен това моделите за редактиране, за които е доказано, че участват в ASD, са специално изследвани в глутаматергичната и серотонергичната системи. 29, 66, GRIK2, чийто геномен локус е многократно свързан и свързан с ASD, се модифицира на три места, което води до образуването на осем протеинови изоформи, които се различават по своята калциева пропускливост. 23 Диференциалното редактиране на GRIK2 между индивиди с ASD и невротипични индивиди е показано на Фигура 2, както на едно място, така и на нивото на цялата изоформа. Анализите на Колмогоров-Смирнов бяха използвани за оценка на значимостта на разликите в непрекъснатите измервания, като тези, които регулират нивата между индивидите с невротип и ASD. Тестът на Пиърсън 2 е използван за сравняване на дискретни разпределения, като например броя на изоформите GRIK2 или HTR2C, получени от комбинаторно третиране с РНК. Относителните честоти на изоформи GRIK2 са значително различни при индивиди с ASD и невротипични индивиди (P

Разлики в редактирането на медиирани изоформи на GRIK2 между невротипни индивиди (синьо) и индивиди с ASD (оранжево). GRIK2 се редактира на три места: I/V, Y/C (и двете части на TM1) и Q/R (TM2), които променят пропускливостта на калциевите рецептори. Установено е, че корекциите на тези сайтове са тясно свързани (Фигура 5б). ( а ) Голяма променливост на корекциите на GRIK2 на всички сайтове сред всички индивиди. Крайностите на наблюдаваните срязващи спектри са индивиди с ASD. Вижте допълнителна фигура 5 за повече подробности. б ) Комбинираното третиране на трите места води до осем изоформи с различни молекулни свойства. Идентифицирани са значителни групови разлики в разпределението на изоформи GRIK2 между индивиди с ASD и невротипични индивиди (P 2, 6), всички недостатъчно представени в ASD (Фигура 3). Вариацията на ASD е много по-голяма от вариацията между невротипната и ASD лица, предлагащи тази находка да се разглежда с повишено внимание и да се преоценява с по-голям размер на извадката.

Разлики в относителния брой изоформи на HTR2C между индивиди с ASD и невротипични индивиди (P 2 тест). Бяха открити общо 21 от възможните 24 изоформи, генерирани от комбинаторна модификация на пет HTR2C места. Най-големите разлики са в IDV, MNV и ISI изоформите, като всички те са повече от удвоени при ASD.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Диференциално относително използване на изоформата ADARB1 при индивиди с ASD

Различия в относителната употреба на неактивната форма на ADARB1 между индивиди с ASD и невротипични индивиди (P = 3, 0e - 3, U-тест на Mann - Whitney). Тази изоформа няма ензимно свързващи двуверижни домени и е доказано, че не е транслирана. 68 ADARB1 е преобладаващият ензим за редактиране на сайтовете, анализирани в това проучване. ( а ) Полуколичествена обратна транскрипция беше използвана за измерване на относителните честоти на изоформите ADARB1 (NR_027672, продукт 122 bp) (NR_027672, продукт 122 bp) (AD_BB), използвайки праймери (черни триъгълници), които откриват и двете. б ) Средната относителна честота на дисфункционалната изоформа ADARB1 е била 46,3 ± 5,6% при ASD и 26 ± 4,5% при невротипични индивиди, подобно на честотата, наблюдавана по-рано в невротипния човешки мозък. 68 Този анализ включва и всички 25 проби, включени в изследването за модификация на РНК. Относителната честота на дисфункционалната изоформа корелира с общите нива на корекция (Pearson's P = 3, 2e - 2). В допълнение, изобилието от дисфункционална форма е количествено определено чрез анализи на експресия на ген TaqMan® по-високо при субекти с ASD (P = 7, 3e - 3, U-тест на Mann - Whitney, допълнителна фигура 12), със значителна връзка между количествената и полуколичествени PCR резултати (Pearson's P = 2.0e-5).

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Тясна връзка между кодирането и сплайсинга в трите AMPA и филамин-А рецептора

Използвани са дълги 454 показания (допълнителна фигура 2) за изследване на регулаторните характеристики на модификацията на човешката РНК, включително предсказаните преди това връзки 6, 69 между кодиращата селекция и алтернативната селекция на сплайсинг при трите AMPA (GRIA2, GRIA3 и GRIA4) и филамин-А (FLNA) рецептори. GRIA2, GRIA3 и GRIA4 съдържат два взаимно изключващи се екзона, които модулират кинетиката на анестезия, наречени флип и флоп. 7 Настройки в 3 'края на екзона непосредствено преди флип/флоп модула бяха силно свързани с изоформата на флопа в GRIA4 (коефициент на вероятност (ИЛИ) = 101,9 (95% CI 87, 8–118, 2)), GRIA3 ( ИЛИ = 30, 6 (26, 8–34, 8)) и в по-малка степен GRIA2 (ИЛИ = 2, 6 (2, 4–2, 8); всички P стойности

Връзки между редакции и разфасовки и между страници. ( а ) Модификации в 3 'края на екзона непосредствено преди флип/флоп модула са силно свързани с изоформата на флопа в GRIA4 (OR = 101, 9 (95% CI 87, 8–118, 2)), GRIA3 (ИЛИ = 30, 6 (26, 8–) 34,8)) и в по-малка степен GRIA2 (ИЛИ = 2, 6 (2, 4–2, 8); всички стойности на P 0, 97, точен тест на Фишър), докато GRIA2 Q/R −4 е напълно неприспособена, GRIA2 Q/R е напълно модифицирана и GRIA2 Q/R +4 вариабилно модифицирана между индивидите, между 4 и 17%.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Друга връзка между кодирането и сплайсинга беше изследвана във FLNA, където беше установено, че модификациите в 3 'края на екзон 43 значително корелират със задържането на интрон 43 (Pearson P 0, 7 между всички двойки сайтове в клъстера, във всички проби (допълнителна таблица 6) Клъстерът с най-силна корелация съдържа шест места в четири гена (GRIA2R/G, CYFIP2 K/E, GRIA3R/G-1 и GRIK2 I/V, Q/R и Y/C) (Pearson's r = 0.8, P 0, 97, Фигура 5в и Допълнителна таблица 5), което показва, че тяхната подредба е пространствено различна във времето и/или се предава от различни комплекси.

дискусия

Това проучване представлява първоначално разследване на ASD модификация на A-to-I RNA, форма на взаимодействие между ген и околна среда, която прецизира синаптичната функция в отговор на стимулите на околната среда. Човешките гени, които се подлагат на редакция, по-често участват в процесите, засегнати от невроразвитие, 17, 18 и A-to-I нарастват като цяло в човешката линия. 26, 27, 28 Макар да се знае малко за ефекта от модификацията на РНК върху хората, има убедителни доказателства в подкрепа на ключова роля за модификацията A-to-I в модулирането на сложното поведение при животните. 1, 2, 3, 41, 44, 70 Мишки и мухи с променени нива на кондициониране рекапитулират няколко поведенчески хомолога към ASD при хора. 1, 41, 44 Генетично специфични проучвания върху животни показват причинно-следствена връзка между нивата на модификация и специфичното неадаптивно поведение, 1, 10 и между специфичните експозиции на околната среда и нивата на модификация. 71 Резултатите, представени тук, следователно изясняват ролята на епигенетичния механизъм, който съчетава екологични сигнали и последващи поведенчески резултати и интегрира генетична и екологична информация.

Наличност на данни

Достъпът до първоначалните показания на последователността може да бъде намерен в Националната база данни за изследвания на аутизма под номер за присъединяване NDARCOL0001951.