абстрактно

Предназначение: Окислителното фосфорилиране е под двоен генетичен контрол на ядрената и митохондриалната ДНК (mtDNA). Нарушенията на окислителното фосфорилиране са клинично и генетично хетерогенни, което затруднява идентифицирането на генетичен дефект и протоколите, базирани на симптоми, които свързват клиничните симптоми директно със специфичен mtDNA ген или мутация, изоставащи. Освен това се изчислява, че приблизително 25% от педиатричните пациенти с нарушения на окислителното фосфорилиране имат мутации в mtDNA и стандартен скрининг подход за често срещани мутации и делеции обяснява само някои от тези случаи. Затова тествахме нов метод за скрининг на mtDNA, базиран на CHIP.

Методи: Проведено е повторно секвениране на MitoChip (Affymetrix) на три тестови проби и на 28 пациентски проби.

Резултати: Честотата на разговори беше средно 94%, а нивата на хетероплазматично откриване варираха от 5-50%. Генетична диагноза може да бъде направена при почти една четвърт от пациентите с потенциална продукция от 8 пълни mtDNA последователности на всеки 4 дни. В допълнение бяха идентифицирани редица потенциално патогенни некласифицирани варианти (UV).

Заключения: Наличието на PCR протоколи на дълги разстояния и преобладаването на единични нуклеотидни замествания в mtDNA правят CHIP секвенирането много бърз и надежден метод за скрининг на пълна mtDNA за мутации.

Основното

Нарушенията на окислителното фосфорилиране (OXPHOS) засягат поне 1 на 8000 от общото население и принадлежат към групата на най-често срещаните наследствени метаболитни заболявания. Проявите на заболяването, причинено от OXPHOS дефекти, могат да бъдат много променливи, но обикновено включват тъкани с голямо енергийно потребление, като сърце, мускули, бъбреци и ендокринни системи. Известни са няколко добре описани синдрома, като Kearns-Sayre (KSS) и синдром на Pearson, невропатия атаксия ретинит пигментоза (NARP), митохондриална енцефаломиопатия, лактатна ацидоза и подобни на инсулт епизоди (MELAS) и миоклонална епилепсия (MER червено) и o. ). Дефектите на OXPHOS обаче могат да се проявят и с по-чести и по-малко специфични симптоми, като диабет тип 2, глухота, енцефалопатия, миопатия и кардиомиопатия. Следователно разстройствата на OXPHOS причиняват значителна заболеваемост и смъртност и имат широко въздействие върху общественото здраве.

Приблизително 25% от педиатричните пациенти с OXPHOS нарушения имат мутации в mtDNA, но са трудни за намиране поради генетична и клинична хетерогенност. 3 Тъй като броят на мутациите на mtDNA се е увеличил до над 250 и клиничната специфичност изостава, протоколите, базирани на симптоми, са недостатъчни и се предпочита скрининг за цяла mtDNA. 4 Наскоро въведеният MitoChip (Affymetrix) е нов метод за резекция на mtDNA. 5, 6 В тази статия ние описваме нашия опит с пълен скрининг на mtDNA при 28 пациенти с OXPHOS, използващи MitoChip последователност.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Пациент и тестови проби

Геномната ДНК е изолирана от мускулите съгласно протокола на Mullenbach et al. ДНК от 3 конвенционално секвенирани пациенти, пациент с хетероплазматична 5 bp делеция, 8 и 28 пациенти с клиничен и/или биохимичен фенотип на OXPHOS заболяване бяха анализирани на MitoChip. Всички тези пациенти са били отрицателни за MELAS m.3243A> G, MERRF m.8344A> G и NARP m.8993T> C/G мутации и големи делеции на mtDNA.

MitoChip и експериментална процедура

Анализ на данни

Affymetrix GeneChip DNA Analysis Software (GDAS) версия 3.0.1.3 бета е използвана за анализ на .CEL файлове, използвайки настройките по подразбиране на програмата. Файлът с отчета е създаден от GDAS със списък с нуклеотидни варианти и за двата фрагмента на чипа в сравнение с Ревизираната референтна последователност в Кеймбридж (RCRS). 4, 11 Разликите между нуклеотидните предизвикателства и за двата чип фрагмента бяха оценени ръчно. Последните големи промени са записани в текстов файл ("изходен изходен файл"). Вторият анализ е извършен с помощта на R, безплатна софтуерна среда за статистически изчисления и графики. 12 При R анализ всеки чип (.CEL файл) се анализира поотделно. Нуклеотидът с най-висок интензитет на сигнала се определя за всяка позиция, като се пренебрегва фоновият сигнал. Нуклеотидните промени бяха отпечатани в текстов файл ("R изходен файл"). И накрая, „изходните изходни файлове“ и „R изходните файлове“ бяха сравнени и комбинирани, което доведе до списък с варианти за всяка проба. Несъответствията между изхода на GDAS и R се оценяват ръчно чрез разглеждане на изображението на чипа или чрез конвенционално секвениране. Освен ако не е посочено друго, в този документ терминът "MitoChip анализ" се отнася до комбинирания анализ на GDAS и R.

Валидиране на хетероплазматични вариации и нива

И двете нишки на варианта на носещия фрагмент бяха последователно циклично използвани с помощта на комплекта за секвениране на цикъл BigDye Terminator v3.1, генетичния анализатор ABI-PRISM 3100 и софтуерния пакет Sequence Analysis 3.7. Нивото на хетероплазма се определя чрез специфично за мутацията храносмилателно храносмилане. В случай, че се получи или загуби рестрикционно място, фрагментите се амплифицират с помощта на праймери, обграждащи вариацията на основата, в противен случай е създаден специфичен несъответстващ грунд, за да се създаде рестрикционен сайт. За PCR амплификация, белязан праймер беше добавен към реакцията в последния PCR цикъл за маркиране на PCR продуктите. Етикетираните PCR продукти се усвояват и фрагменти се анализират на генетичен анализатор ABI-PRISM 3100, използвайки софтуерния пакет GeneScan Analysis 3.7 (Applied Biosystems). Нивото на хетероплазма се определя чрез изчисляване на съотношението на мутантния или дивия тип пикова площ (в зависимост от печалбата или загубата на рестрикционното място от нуклеотидна вариация) и сумата от площите на мутантния и дивия тип пикове. Първичните последователности и реакционните условия са на разположение при поискване.

РЕЗУЛТАТИТЕ

Изпълнение и проверка на MitoChip

вариация на mtDNA при 28 пациенти

Общо 520 вариации са открити при 28 пациенти, от които 197 са уникални нуклеотидни замествания. Открити са общо 15 хетероплазмени вариации при общо 11 пациенти. Четири от тези вариации бяха потвърдени чрез секвениране и специфично за мутация рестрикционно смилане (m.15939C> T при 7%, m.13513G> A при 14%, m.3243A> T при 34% и m.13042G> A при 84% ); две бяха показани като хомоплазматични вмъквания от двойка основа (m.3229_3230insA и m.3158_3159insT); две се оказаха фалшиво положителни; един се оказа хомоплазмен полиморфизъм (m.15452C> A); останалите шест не са тествани, тъй като не се считат за патогенни. От всички открити вариации са известни три патогенни мутации (Таблица 1), 114 са публикувани като полиморфизми (Допълнителна таблица 1), 41 не водят до промени в аминокиселините и най-вероятно са полиморфизми (Допълнителна таблица 1) и 39 са некласифицирани (UV)., Някои от които вероятно са патогенни (Таблица 2). Осем варианта са локализирани в молекулите на тРНК (фиг. 1). При три пациенти са открити известни патогенни мутации, а при 23 пациенти е установено UV. Открити са само полиморфизми при петима пациенти.

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

базиран

Осем мутации на tRNA (некласифицирани варианти и мутации) са открити при 28 пациенти с OXPHOS. Вариацията m.3243A> T в тРНК-Leu1, вариация m.4336T> C в гена tRNA-Gln, m.5558A> Вариация на G в гена tRNA-Trp, m.5592A> Вариация G в tRNA-Ala ген, m .5850T> C вариация в tRNA-Tyr гена, m.12308A> G вариация в tRNA-Leu2 гена и m.15890C> T вариация и m.15939C> T вариация в tRNA-Thr гена. Изображенията са адаптирани от уебсайт, който се занимава със съставянето на гени за тРНК на бозайници (//mamit-trna.u-strasbg.fr/index.html). 32

Изображение в пълен размер

UVs бяха оценени за еволюционна защита, за функционална значимост, чрез определяне на ефекта върху tRNA или протеина и, ако е налице, върху сегрегацията в семейството. Седем UVs бяха локализирани в шест tRNA гени (Фиг. 1), 11 UVs в 12S и 16S rRNA гените, едно UV в мястото на терминатор на транскрипция на mtDNA и 20 UVs в гените, кодиращи протеини. От осемте варианта на tRNA (фиг. 1), вариацията m.15939C> T в гена tRNA-Thr е хетероплазматична с мутационно натоварване от 7%. Другите варианти на тРНК са хомоплазмени или близки до хомоплазматични (> 98% мутационно натоварване). Две от вариациите в гените, кодиращи протеина, са хетероплазматични 84% и 70% за m.13042G> A в гена ND5 и m.14258G> A в гена ND6.

Открити са и единични нуклеотидни вмъквания. Преходът на хетероплазмен m.3158A> T към CHIP показа, че стандартното секвениране е вмъкване на единичен нуклеотид (m.3158_3159insT). В допълнение, хомоплазменото вмъкване на m.3229_3230insA първоначално беше открито чрез анализ на MitoChip като хетероплазмен m.3229T> A преход.

ДИСКУСИЯ

Изпълнение и проверка на MitoChip

MitoChip в сравнение с други методи

Маса в пълен размер

Вариация на MtDNA в 28 клинични проби

Повторението не само открива известни патогенни мутации или полиморфизми, но също така UV и рискови фактори за несвързана патология, като рак, болест на Алцхаймер или болест на Паркинсон. Тъй като значението на тази втора група вариации за отделни случаи и техните семейства все още е неясно и рисковите фактори не могат да обяснят първичната патология, е ясно, че тези данни трябва да бъдат внимателно адресирани от клиницистите. Пациентите трябва да бъдат инструктирани относно несигурността на някои наблюдения и трудността при интерпретирането на някои от резултатите. Необходимо е обаче и не претегля генетичните диагнози. Това също ще бъде временен проблем, тъй като в резултат на усилията за съвместно секвениране ще бъде налична повече информация за неутрални полиморфизми, реални рискови фактори за болестта и реални патогенни мутации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Повторното определяне на MitoChip е бърз, икономически ефективен и надежден метод с високоефективни възможности за пълен mtDNA скрининг. Четвърт от пациентите с OXPHOS могат да бъдат генетично диагностицирани чрез тази техника чрез откриване на три патогенни и три или четири вероятни патогенни мутации при 28 пациенти, потвърждавайки горния процент. 3 Поради нарастващия брой мутации на mtDNA в комбинация с нарастваща клинична хетерогенност, повторното определяне на MitoChip е предпочитаният метод за скрининг на mtDNA за мутации, особено когато специфичен за симптомите скрининг и скрининг само на най-често срещаните мутации на mtDNA не достига.

Благодаря

Това изследване беше подкрепено от фондация „Принцеса Беатрикс“ (номер на гранта: MAR99-0111) и проект MitoCircle (грант на ЕС, Шеста рамкова програма, договор № 005260).