лираглутид

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Комбинираната терапия с метформин и лираглутид е по-ефективна от единичната терапия за защита срещу ендотелна дисфункция, индуцирана от палмитинова киселина (PA).
  • Ефекти на комбинираната терапия с метформин и лираглутид върху съдовата ендотелна функция при ApoE -/- мишки
  • Индуцирано от метформин повишаване на нивата на GLP-1 рецептор (GLP-1R) и протеин киназа А фосфорилиране (PKA) могат да допринесат за синергичните защитни ефекти на комбинираната терапия.
  • Метформин възстановява PA-нарушени нива на GLP-1R и PKA фосфорилиране в HUVEC чрез AMP-активирана протеин киназа (AMPK).
  • дискусия
  • Материали и методи
  • реагенти
  • Проучвания инвитро
  • Изготвяне на PA
  • Клетъчна култура и лечение
  • РНК интерференция
  • Откриване на вътреклетъчни ROS
  • Откриване на НЕ супернатант
  • Уестърн петно
  • Проучвания in vivo
  • звяр
  • Подготовка на аортни пръстени и измерване на вазодилатация
  • HE и оцветяване с имунохимия
  • Статистически анализ
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Диабетни усложнения
  • Хормонални рецептори

абстрактно

Кохортните проучвания и мета-анализите показват, че диабетът тип 2 е силно свързан с повишен риск от много атеросклеротични сърдечно-съдови заболявания 1, 2. Въпреки че точните механизми, отговорни за ускорената атеросклероза, не са напълно изяснени, ендотелната дисфункция е показана като едно от най-ранните събития в развитието на атеросклероза. Ендотелната дисфункция се характеризира с намален синтез на азотен оксид (NO) и/или бионаличност в периендотелната среда, където NO е отговорен за поддържането на целостта на съдовата тъкан 3 .

Метформин е най-често предписваното лекарство за лечение на хипергликемия при пациенти с диабет тип 2. Клиничните проучвания демонстрират благоприятните ефекти на метформин върху сърдечно-съдовата система 4, 5, 6. В допълнение, метформин може директно да предпази ендотелните клетки от увреждане, което надхвърля неговите ефекти на понижаване на глюкозата 7, 8. Агентите, подобни на глюкагон-пептид-1 (GLP-1) (включително аналози на GLP-1 и инхибитори на дипептидил пептидаза 4), са одобрени наскоро като нови терапевтични възможности за пациенти с диабет тип 2 въз основа на доказателства, че GLP-1 може да стимулира инсулинозависим секреция от глюкоза от ß клетки на панкреаса. В допълнение към ефекта на понижаване на глюкозата, GLP-1 има и други екстра-панкреатични ефекти. Неотдавнашното проучване LEADER (Лираглутиден ефект и действие при диабет: оценка на сърдечно-съдовите резултати) показва, че лечението с аналог на лираглутид и аналог на GLP-1 намалява сърдечно-съдовите събития и смърт при пациенти с диабет тип 2 9. Важното е, че съдовият ендотел играе важна роля за поддържане на сърдечно-съдовата функция 10. Нови доказателства сочат, че GLP-1 и неговите аналози имат директен защитен ефект върху съдовия ендотел 11 .

В клинично изпитване комбинираната терапия с лираглутид и метформин показва значително по-висока загуба на тегло и по-ниска честота на хипогликемия в сравнение с комбинирана терапия с глимепирид и метформин 12, 13. В допълнение, при пациенти с диабет тип 2 с адекватен гликемичен контрол с монотерапия с метформин, добавянето на лечение с лираглутид е подобрило няколко маркера на сърдечно-съдовия риск, което предполага, че метформинът и лираглутидът могат да имат допълнителни или дори синергични ефекти върху васкулатурата 14. Все пак дали тази комбинирана терапия има синергичен ефект върху ендотелните функции все още не е ясно поради липсата на свързани експериментални доказателства. Следователно в това проучване ние се фокусирахме върху изследването на ефектите на комбинираната терапия с метформин и лираглутид върху ендотелната дисфункция, предизвикана от липотоксичност, и върху изследването на основния механизъм.

резултатът

Комбинираната терапия с метформин и лираглутид е по-ефективна от единичната терапия за защита срещу ендотелна дисфункция, индуцирана от палмитинова киселина (PA).

В култивирани ендотелни клетки от човешка пъпна вена (HUVEC), PA индуцирана ендотелна дисфункция, която се характеризира с повишено производство на реактивни кислородни форми (ROS), намалени нива на NO и намалени нива на вътреклетъчна фосфорилирана ендотелна NO синтаза (p-eNOS) в зависим от концентрацията начин. метод (фиг. 1а). Индуцираната от PA ендотелна дисфункция (0,5 mmol/l) се отслабва чрез еднократно третиране с по-висока доза метформин (0,5 и 1,0 mmol/l) или лираглутид (30 и 100 nmol/l). Въпреки това, при по-ниска доза метформин (0,1 mmol/l) или лираглутид (3 и 10 nmol/l) не се наблюдава такъв защитен ефект (Фигура 1b, c). Забележително е, че комбинираното лечение с по-ниска доза метформин (0,1 mmol/l) и лираглутид (3 nmol/l) имаше значителен защитен ефект върху индуцираното от PA повишено регулиране на производството на ROS и намаляване на нивата на NO и p-eNOS протеин (Фиг. 1). 1г, Допълнителна Фигура 1), което показва, че комбинираната терапия е по-ефективна от еднократно лечение за защита срещу индуцирана от PA ендотелна дисфункция.

( а ) Зависими от дозата ефекти на PA върху ендотелната функция в HUVEC, включително вътреклетъчно производство на ROS (горен панел), НЯМА нива на супернатант (среден панел) и нива на p-eNOS протеин (долен панел). HUVECs са били предварително обработени с различни концентрации на метформин ( б ) и лираглутид ( ° С ) самостоятелно или в комбинация с двете ( д ) в продължение на 2 часа и след това се излага на PA за още 22 часа. Данните са представени като средни стойности ± SD. n = 4. * P # P -/- мишки

а ) Нарушени нива на фосфорилиране на GLP-1R и PKA в HUVEC, третирани с PA. ( б ) Зависими от дозата ефекти на метформин върху нивата на GLP-1R и PKA фосфорилиране в HUVEC с нарушена PA. Нивата на GLP-1R или p-PKA протеини се нормализират до GAPDH или общите PKA протеини. Данните са представени като средни стойности ± SD. n = 4. * P # P

Клетките се инкубират с GLP-1R антагонист екзендин (9-39) ( а ) или PKA H89 инхибитор ( б ) в продължение на 30 минути и след това се третира с метформин и лираглутид в продължение на 2 часа и след това се излага на PA за още 21,5 часа. Изследвана е ендотелната функция, включително продукция на ROS (горен панел), ниво на NO (среден панел) и ниво на протеин p-eNOS (долен панел). Данните са представени като средни стойности ± SD. n = 4. * P # P † P

HUVECs бяха предварително обработени с AICAR AMPK активатор за 2,5 часа или AMPK C инхибитор за 30 минути и след това третирани само с метформин (1,0 mmol/l) ( а, б ) или комбинация от метформин (0,1 mmol/l) и лираглутид (3 nmol/l) ( ° С, д ) в продължение на 2 часа, последвано от излагане на PA за още 21,5 часа. GLP-1R нива на протеин ( а, ° С ) или p-PKA ( б, д ) се нормализират до GAPDH протеини или общ PKA. Данните са представени като средни стойности ± SD. n = 4. * P # P † P 10. Причинно-следствената връзка между свободните мастни киселини и ендотелната дисфункция е демонстрирана по няколко начина 16, 17, 18, 19. PA е една от най-често срещаните мастни киселини в западната диета. В нашето проучване in vitro РА значително нарушава ендотелната функция, което предполага повишено вътреклетъчно производство на ROS и намалени нива на NO и фосфорилиране на eNOS. По същия начин нашето проучване in vivo демонстрира, че вазодилатационно-зависима вазодилатационно-зависима вазодилатация при ApoE -/- мишки, хранени с HFD.

AMPK и PKA са два ключови регулатора на клетъчния метаболизъм. Взаимодействието между AMPK и PKA е добре документирано в няколко проучвания 40, 41, 42. Активирането на AMPK увеличава PKA активността, докато PKA независимо или инхибира Ser/Thr-специфичната протеинова фосфатаза-2C активност, като по този начин индиректно модулира AMPK активността в първичните съдови клетки на гладките мускули на плъхове 41. В това проучване открихме, че активирането на AMPK отслабва PA-индуцираното намаляване на PKA фосфорилирането в HUVEC. Нашите открития могат да хвърлят нова светлина върху сигналната мрежа в ендотелните клетки. В допълнение, инхибирането на PKA отслабва ефектите на метформин върху индуцираната от PA ендотелна дисфункция, което предполага, че PKA може да участва в защитните ефекти на метформин върху ендотелните клетки. Независимо от това са необходими допълнителни проучвания за определяне на кръстосани връзки между AMPK и PKA пътищата за подобряване на ендотелната функция.

В обобщение, комбинираната терапия с метформин и лираглутид, аналог на GLP-1, има синергичен ефект срещу индуцирана от PA ендотелна дисфункция. Функцията на метформин при повишаване на нивата на GLP-1R и фосфорилиране на PKA в ендотелните клетки може да допринесе за синергичния защитен ефект на тази комбинирана терапия, която дава нова представа за взаимодействието между метформин и GLP-1 агенти (фиг. 7). Възможно е метформин да е в състояние да засили или засили съдовите защитни ефекти на GLP-1 и неговите аналози. Нашите открития предоставят важна информация за разработването на нови терапевтични стратегии, базирани на GLP-1 при лечението на диабет тип 2.

Индуцирана от палмитинова киселина (PA) ендотелна дисфункция се характеризира с повишено производство на ROS, намалени нива на NO и намалено фосфорилиране на eNOS. Лечението само с метформин или лираглутид може да предотврати дисфункция, предизвикана от PA ендотелни клетки. Комбинираната терапия с метформин и лираглутид има синергичен ефект върху индуцираната от PA ендотелна дисфункция. В допълнение, метформинът регулира GLP-1R и неговата PKA сигнализация, която може да бъде отговорна за неговите синергични защитни ефекти с лираглутид в ендотелни клетки с увредена PA. Метформин може също да активира PKA сигнализиране по начин, независим от GLP-1R. Горните ефекти на метформин се медиират от пътя на AMPK. Червените стрелки показват новите ни открития в това проучване.

Изображение в пълен размер

Материали и методи

реагенти

Лираглутид е предоставен от Novo Nordisk (Bagsvaerd, Дания). PA, AMPK инхибитор Съединение С и GLP-1R антагонист екзендин (9-39) са закупени от Sigma (Сейнт Луис, МО, САЩ). Активаторът AMPK AICAR е от Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). PKA инхибиторът H89 се осигурява от Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Миши анти-eNOS и анти-фосфо-Ser-1177-eNOS (p-eNOS) антитела са от BD Biosciences (Сан Джо, Калифорния, САЩ). Мишето анти-GLP-1R моноклонално антитяло е от DSHB (Iowa, IA, USA). Заешки анти-PKAα, анти-фосфо-Thr197-PKA C (p-PKA), анти-AMPKα и анти-фосфо-Thr-172-AMPKα (p-AMPK) са получени от технологията за клетъчна сигнализация. Миши анти-GAPDH антитела от Zhongshan Biotechnology (Пекин, Китай).

Проучвания ин витро

Изготвяне на PA

PA 256 mg се разтваря в 5 ml абсолютен етанол и след това се титрува с 0,1 ml/l натриев хидроксид 5 ml при 70 ° C. Накрая се получава смес от 10 ml PA с 190 ml 10% BSA при 55 ° C. добавя се за образуване на комплекс при концентрации 5 mmol/l. Основният разтвор се стерилизира чрез филтруване и се съхранява при -20 ° C. По същия начин се приготвя контролен разтвор, съдържащ 5% етанол и 9,5% BSA.

Клетъчна култура и лечение

HUVEC са събрани от здрави донори с писмено информирано съгласие. Протоколът от това проучване е одобрен от Комитета по етика на Трета болница в Пекин. Всички извършени процедури бяха в съответствие със съответните насоки и разпоредби. HUVECs бяха приготвени и култивирани, както е описано по-горе 43. Всички експерименти бяха проведени с използване на клетки при пасаж 6. Поредица от концентрации на РА (0, 125, 0, 25 и 0.5 mmol/l) бяха използвани за инкубиране в продължение на 24 часа, за да се предизвика ендотелна дисфункция. В по-голямата част от нашето проучване като повреден модел се използва експозиция на HUVEC от 0,5 mmol/l PA. Предварителната обработка на HUVECs с метформин (0, 1, 0, 5 и 1.0 mmol/l) или лираглутид (3, 10, 30 и 100 nmol/l) се извършва 2 часа преди експозицията на PA и за 22 часа. В комбиниран експеримент клетките се третират с метформин (0,1 mmol/l) и лираглутид (3 nmol/l). За да се изяснят включените сигнални пътища, клетките се инкубират с AICAR (0.5 mmol/L), Съединение C (10 μmol/L), Exendin (9-39) (200 nmol/L) или H89 (10 μmol/L). за 30 минути. мин. преди други лечения.

HUV-EC-C, клетъчна линия на HUVEC, беше използвана в експеримента за нокдаун. Тази клетъчна линия е от Центъра за клетъчни ресурси към Шанхайския научноизследователски институт за живот (Китай) и е култивирана в DMEM (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, САЩ), допълнена с 10% FBS.

РНК интерференция

За да се заглуши експресията на GLP-1R и PKA гените, клетките бяха трансфектирани с siRNAs, използвайки липофектамин RNAi MAX (Invitrogen). Три форми на siRNA бяха включени за всеки нокдаун на специфичен ген и несвързана кодирана siRNA беше използвана като контрола, без никаква идентичност в човешката геномна последователност. След трансфекция в продължение на 48 часа, клетките се третират с метформин (1,0 mmol/l) в продължение на 2 часа, последвано от експозиция на PA за още 22 часа.

Откриване на вътреклетъчни ROS

ROS се измерва като се използва 2 ', 7'-дихлорофлуоресцин диацетат флуоресцентна сонда (DCFH-DA, Sigma), която може да се хидролизира до DCFH в клетките. Когато нефлуоресцентният DCFH се окисли от ROS, той ще се превърне във високофлуоресцентен DCF. Накратко, в края на лечението клетките се инкубират с DCFH-DA (20 μmol/L) за 30 минути при 37 ° С и след това се промиват два пъти. Интензитетът на флуоресценция на DCF беше тестван с проточен цитометър (BD Biosciences). Контролите бяха определени като 100% ROS нива.

Откриване на НЕ супернатант

NO се определя по метода на нитрит редуктазата, като се използва комплект от Beijing 4A Biotech Co., Ltd (Китай). В края на лечението от всяка група се събират супернатанти на клетъчни култури. За да се установи анализът, се приготвят епруветки с 0,1 ml дестилирана вода, стандартен разтвор и проби за третиране и след това към всяка епруветка се добавят PBS и нитратна редуктаза. След инкубация в продължение на 1 час при 37 ° С, бяха добавени два работни разтвора за коинкубация за още 10 минути. Абсорбцията при 450 nm във всяка епруветка се измерва с помощта на четец за микроплаки. Нивото на NO на всяка група се нормализира до нейния общ протеин.

Уестърн петно

Протеините се разделят с 10% (w/v) SDS-PAGE и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. Мембраните бяха тествани с първични антитела (всички при разреждане 1: 1 000) за една нощ при 4 ° С и впоследствие инкубирани с конюгиран с IRDye 800CW кози анти-заешки IgG или кози анти-миши IgG (и двата при разреждане 1: 10 000); LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) за 1 час. Протеиновите ленти бяха визуализирани с помощта на инфрачервена система за изображения на Odyssey (LI-COR Biosciences).

Проучвания in vivo

Експериментите с животни са одобрени от Комитета за грижа и използване на животните в Пекинския университет и са извършени в съответствие с националните и международните насоки. Осемседмични мъжки мишки от див тип и ApoE -/- (Vital River Animal Center, Пекин, Китай) бяха настанени при специфични условия, свободни от патогени с 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Експериментите са проведени след една седмица на аклиматизация. Мишките от див тип са били хранени с нормална диета, докато ApoE -/- мишките са били хранени с HFD, съдържащ 0,15% холестерол и 41% мазнини (MD12015, Medicine Ltd, Yangzhou, Jiangsu, China) в продължение на 8 седмици. През последните четири седмици ApoE -/- мишките бяха разделени на четири групи (6 мишки на група), включително контролни (PBS, ip, два пъти дневно), метформин (100 mg/kg на ден, питейна вода и PBS) ip, два пъти дневно), лираглутид (30 μg/kg на ден, ip, два пъти дневно) и комбинацията (метформин, 100 mg/kg на ден, с питейна вода; и лираглутид, 30 μg/kg на ден, ip, два пъти) дневно ). Преди лечението се измерва телесното тегло и след това седмично до умъртвяването.

Подготовка на аортни пръстени и измерване на вазодилатация

След лапаротомия по средната линия под натриева пентобарбитална анестезия, аортата бързо се изрязва, за да се измери съдовата реактивност, както е описано по-горе 44. След стабилизиране в буфер на Krebs в продължение на 30 минути, аортните пръстени се деполяризират с калиев хлорид (60 mmol/l), за да се оцени тяхната максимална контракция. След две измивания аортните пръстени бяха изтеглени чрез стимулация с фенилефрин (10-6 mol/l). Когато контрактилната реакция беше стабилизирана (фаза в стационарно състояние, 15 минути), бяха изследвани вазорелаксиращи отговори на повишена концентрация на Ach. Напрежението в покой на аортните пръстени се регулира на 1,0 g. Промени в съдовото напрежение бяха открити от записващо устройство за писане (ADInstruments, Bella Vista, Австралия).

HE и оцветяване с имунохимия

Аортните тъкани, включително аортни корени и възходяща аорта, бяха събрани за подготовка на участъци с дебелина 7 μm. Разделите на тъканите първо бяха идентифицирани чрез оцветяване с НЕ. За оцветяване с имунохимия, срезовете бяха третирани с 3% водороден пероксид в продължение на 10 минути, за да се блокира ендогенната пероксидазна активност, и инкубирани в буфериран нормален конски серум, за да се предотврати неспецифичното свързване на антителата. След това срезовете бяха инкубирани с антитяло срещу p-eNOS (1:50; Sigma) или GLP-1R (1:10) в продължение на една нощ при 4 ° С и подложени на имунохистохимичен анализ.

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± SD. Разликата между групите беше анализирана чрез еднопосочен ANOVA, последван от post-hoc тест на Tukey-Kramer. Стойност P