риск

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Промени в лигавицата на дебелото черво след промяна в диетата
  • Промени в микробния метаболизъм на дебелото черво след промяна в диетата
  • Глобални промени в метаболизма след промяна в диетата
  • Глобални асоциации на микроби и метаболити
  • Диета с ниско съдържание на фибри и токсични микробни метаболити с високо съдържание на мазнини
  • дискусия
  • методи
  • Уча дизайн
  • Субекти и набиране на персонал
  • проекция
  • Допустимост на субекта
  • Вземане на проби от фекалии, дебелото черво и лигавицата и колоноскопия
  • Измерване на лигавичните биомаркери
  • имунохистохимия
  • Количествено определяне на имунохистохимичното оцветяване
  • Ki67
  • CD3
  • CD68
  • Целеви анализ на фекални и дебелочревни микроби и метаболити от особен интерес
  • Плазмени аминокиселини
  • Статистически анализ
  • Глобален анализ на състава и разнообразието на микробиотите
  • HITChip анализ
  • Анализ на микробна съпътстваща мрежа
  • Глобален анализ на метаболома: подготовка на пробата за ЯМР спектроскопски анализ
  • 1Н NMR спектроскопия
  • Анализ на многовариантни статистически данни
  • Генериране на метаболитна реакционна мрежа
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Рак на дебелото черво
  • епидемиология
  • Хранене
  • Рискови фактори

абстрактно

От резултатите от две наскоро публикувани проучвания при хора знаем, че модификациите в съдържанието на фибри и мазнини в диетата имат основен ефект върху микробиотата в дебелото черво в продължение на няколко дни 11, 12. Тук ние предоставяме критична информация за функционалното значение на тези промени в микробиотата върху лигавицата на дебелото черво чрез промяна на съотношението на мазнините и фибрите в диетата при двата ни високо- и нискорискови рака на дебелото черво. Използвайки дизайна на изследването, посочен в Таблица 1, ние демонстрирахме очакваното увеличаване на захаролитичната ферментация и бутирогенеза и потискане на вторичния синтез на жлъчна киселина, произведен от прехода на афро-американците към диета с високо съдържание на фибри и ниско съдържание на мазнини в продължение на 2 седмици, свързана с значително намаляване на биомаркерите на възпалението и брутното разпространение.черевен риск от рак. За разлика от това, промяната в диетата в селските африканци към диета с ниско съдържание на фибри и ниско съдържание на фибри е довела до обратими промени във всички тези параметри.

Маса в пълен размер

резултатът

Промени в лигавицата на дебелото черво след промяна в диетата

( а ) Преглед на значително променени родоподобни бактериални групи (FDR 1 преди и след хранене и поне r |> 0, 5. Положителните корелации са обозначени със зелени линии; отрицателни корелации с червени линии. Идентично оцветените възли показват мрежови модули с три или повече едновременно срещащи се сиви възли представляват модули от по-малко от три едновременни групи или тези, които не са представени от модула. Размерът на извадката е 20 афроамериканци и 17 селски (местни) африканци.

Изображение в пълен размер

Глобални промени в метаболизма след промяна в диетата

Изображение в пълен размер

Изображение в пълен размер

Маса в пълен размер

Глобални асоциации на микроби и метаболити

За да изследваме това, направихме частичен корелационен анализ между микроби на ниво род и метаболити на урината и фекалиите (Фиг. 4b), адаптиран към националността и диетата. Въпреки че не можем биологично да обясним всички асоциации (например, пропионат корелира с ентеробактерии и стрептококи, за които не е известно, че произвеждат пропионат), една поразителна черта е, че метаболитът на бутирата е свързан изключително с микробни групи, за които е известно, че съдържат производители на пропионат. Бутират. примери са R. intestinalis and rel., E. rectale и rel. и C. symbiosum и rel., които са показани в съпътстващите мрежи на ФИГ. 3б да се увеличи, когато и двете части от населението консумират диета с високо съдържание на фибри.

Диета с ниско съдържание на фибри и токсични микробни метаболити с високо съдържание на мазнини

дискусия

методи

Уча дизайн

Субекти и набиране на персонал

Здрави доброволци, съвпадащи с възрастта и пола, с възрастови граници 50–65 години, бяха избрани на случаен принцип от афро-американското население в района на Питсбърг в Пенсилвания и от местните южноафриканци от селските райони в района на Квазулу. Сътрудничихме с д-р Стивън Томас, директор на проучвания за малцинствата в Университета на Питсбърг, училище за обществено здраве, за набиране на здрави афроамерикански доброволци от региона Питсбърг, а също така рекламирахме проучването с одобрението на нашия Институционален съвет за преглед в публични зони. В Южна Африка доброволците бяха набирани чрез реклами, пускани в публични читалища, например пощенски станции, кметства, граждански центрове и чрез iZulu Community Health Center. Подходящо обезщетение (както е препоръчано от проучвания за малцинствата и общността iZulu и е ратифицирано от университета в Питсбърг и KwaZulu-Natal) за време и тестване е изплатено на доброволци за участие.

проекция

От всеки участник беше взето информирано подписано съгласие. Всички африкански доброволци можеха да разбират английски, но медицинска сестра-преводач участваше в процеса на съгласие, за да гарантира правилното разбиране на детайлите на изследователските процедури. Скринингът е извършен в Питсбърг в Центъра за клинични транслационни изследвания и в Африка в амбулаторията на болница Ngwelezana, Empangeni, KwaZulu-Natal, Южна Африка. За първи път беше взета подробна медицинска история. При селските африканци местна двуезична медицинска сестра изпълнява ролята на преводач. Взета е кръвна проба от 20 ml за пълна кръвна картина, ESR, електролити и урея, албумин, алкална фосфатаза, AST и билирубин. Ако резултатите са нормални и ако отговарят на критериите за допустимост, те са поканени да участват в проучването.

Допустимост на субекта

Подробностите са дадени в допълнителна бележка 1. Критериите за включване са както следва: здрави доброволци, от гледна точка на стомашно-чревния тракт между 40 и 65 години (възраст, на която се препоръчва скрининг на рак на дебелото черво/колоноскопия при тази популация) и индекс на телесна маса между 18 и 35 kg m -2 (допълнителна дискусия). Критериите за изключване бяха следните: участниците преди колоноскопията не отговаряха на условията, ако имаха анамнеза за фамилна аденоматозна полипоза, наследствен неполипозен колоректален рак, възпалително заболяване на червата или инвазивен рак в рамките на 5 години преди записването (прием на h/o аденоматозни полипи). В допълнение, недопустими участници бяха лица с известни бъбречни, чернодробни или кървещи нарушения; предишна операция на стомашно-чревния тракт, водеща до нарушена функция на червата поради загуба на червата или променена анатомия, или всяка форма на хронично заболяване на стомашно-чревния тракт, водеща до нарушена функция на червата, диария и малабсорбция; и лица с употреба на антибиотици през последните 12 седмици (допълнително обсъждане), настоящи стероиди или с диабет. Критериите за изключване след колоноскопия бяха откриване на неразпозната дотогава язва (с дълбочина и> 0,5 cm), стриктура, тежко възпаление и полипи> 1 cm в диаметър или рак.

Вземане на проби от фекалии, дебелото черво и лигавицата и колоноскопия

Измерване на лигавичните биомаркери

Хистология. Биопсиите на лигавицата на дебелото черво се получават чрез колоноскопия преди и след превключване на диетата от три различни места (възходящо, напречно и низходящо) и се съхраняват в 10% буфериран формалин. По-късно пробите за биопсия бяха вградени в парафин и 5-милиметровите срезове бяха изрязани и оцветени или с рутинни хематоксилин и еозин (H&E), или с имунохистохимични петна (виж по-долу). Хистологичните находки на H & E-оцветените секции бяха оценени от един заслепен, опитен гастроентерологичен хистопатолог (AK). Измерванията се фокусираха върху броя на възпалителните клетки и еозинофилите в ламина проприа и броя на интраепителните лимфоцити. Точкуването на H & E оцветената секция се извършва, както е показано в допълнителна таблица 5а. Всяка патологична находка, като наличието на паразитни организми, е регистрирана.

имунохистохимия

Слайдовете за оцветяване на CD3 и Ki67 бяха депарафинизирани при 60 ° С в продължение на 2 часа. За да се инхибира ендогенната пероксидаза, предметните стъкла бяха предварително обработени с използване на 3% водороден пероксид/метанол при стайна температура (RT) за 10 минути, последвано от извличане на антиген с 0,2% разтвор на пепсин (P7012, Sigma, 3050 Spruce St, St Louis, MO, САЩ) при 37 ° С за 10 минути. Протеинов блок без серум (X0909, Dako, 6392 Via Real, Carpinteria, CA 93013, USA) се използва при RT за 10 минути. Слайдовете бяха източени и инкубирани с първични антитела CD3 и Ki67 (A0452, 1: 100, заешки поликлонал, Dako; MIB-1, 1: 100, миши моноклонални, Dako), съответно, при RT за 1 h. Вторичното откриване беше приложено с помощта на универсален комплект за откриване на полимери на Immpress (MP-7500, Vector Labs, 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, USA) при RT за 30 минути. Слайдовете бяха оцветени с DAB субстратен комплект (SK-4100, Vector Labs) в продължение на 10 минути и контра оцветени с използване на Shandon Hematoxylin (6765015, Thermo Scientific, 81 Wyman St, Waltham, MA 02451, USA).

Слайд оцветяването за CD68 е направено върху плъзгач Ventana Benchmark Ultra. Депарафинизираните стъкла се обработват предварително с помощта на ултра CC1 (950-224, Ventana, 1910 Innovation Park Dr, Tucson, AZ 85755, USA) за 24 минути за извличане на антиген. Слайдовете се инкубират с първичното антитяло CD68 (M087601, 1: 100, мишка моноклонално, Clone PG-M1, Dako,) за 32 минути RT. Комплектът Optivew DAB (760-700, Ventana) е използван за вторично откриване.

Количествено определяне на имунохистохимичното оцветяване

Преброяването на пропорциите на положителни оцветяващи клетки с помощта на светлинна микроскопия при увеличение от 400 пъти се извършва от един изследовател (KM), при заслепени условия. За да се оцени вариабилността между наблюдателите, 40 диапозитива бяха избрани на случаен принцип и преразказани от втори старши патолог (АК), показвайки съвпадение от 88% за Ki67 + и 80% за плътности CD68 +.

Делът на Ki67-позитивните оцветяващи клетки се преброява в добре ориентирани крипти (средно/слайд 8, диапазон 4-14). Скоростта на пролиферация на Ki67 се определя като броят на клетките Ki67 +, разделен на общия брой клетки на криптата и се изразява като процент. Установено е, че разликите са еднакви в общата крипта и в горната крипта; следователно тук се отчитат само общите пропорции на криптата.

Само CD3 + оцветяващи интраепителни лимфоцити бяха преброени в представителна зона от поне 300 епителни клетки. Плътността на интраепителните лимфоцити се изразява като индекс на броя на CD3-положителните лимфоцити на 100 епителни клетки.

Броят на CD68-позитивните клетки (макрофаги) в ламина проприа е преброен и степенуван по скала от 1 до 3: степен 1 ​​(няма/рядко), степен 2 (разпръснати повърхностни колекции) и степен 3 (силна, дифузна или лентова -подобен инфилтрат в повърхностната ламина проприа), както е показано на фиг. 1в.

Целеви анализ на фекални и дебелочревни микроби и метаболити от особен интерес

Плазмени аминокиселини

Концентрациите на гладно в кръвта се измерват в екстрахирана плазма чрез обратнофазова С-18 предколонна дериватизация HPLC (AccQ · Tag Ultra дериватизация, Waters, Milford, MA), както е описано по-рано 5 .

Статистически анализ

Статистическият анализ на груповите разлики в непрекъснатите променливи беше извършен с помощта на SPSS 16.0 (SPSS Inc.). Значимостта на груповите разлики за нормално разпределени данни беше оценена с несдвоени и сдвоени t-тестове на Student. Непараметричните данни бяха анализирани с дисперсионен анализ на Mann - Whitney U -test или Kruskal - Wallis (ANOVA) по рангове за несдвоени данни и тестове на Wilcoxon с подписан ранг за сдвоени данни. Значимостта на асоциацията е оценена с теста за корелация на ранг на Spearman. Ниво от P 59, 60, 61, 62, тъй като позволява дълбоко профилиране на филотипове с висока разделителна способност, до 98%) 59 и при значително по-ниска цена.

HITChip анализ

Анализ на микробна съпътстваща мрежа

Глобален анализ на метаболома: подготовка на пробата за ЯМР спектроскопски анализ

Всички проби от урина бяха размразени при RT и завихрени за 10 s. Общо 400 μl проба от урината бяха добре смесени с 250 μl 0,2 М натриев фосфатен буфер, съдържащ 20% D20, pH 7,4, 0,01% 3- (триметилсилил) - [2, 2, 3, 3-2H 4] натриева сол на пропионова киселина и 3 mM натриев азид (NaN 3). Първоначално сместа се центрофугира при 10 000 g в продължение на 10 минути и 600 μl от супернатантата се прехвърля в NMR епруветка с външен диаметър 5 mm. Приблизително 200 mg мокра фекална проба се смесва с 600 μl Н20 (HPLC степен) в 1,5-милилитрова епруветка Eppendorf. След това се провежда цикъл от 30 s завихряне, 5-минутно обработване с ултразвук при 4 ° C и 30 s завихряне върху сместа, последвано от центрофугиране при 10 000 g за 10 минути. Общо 400 μl супернатант се добавят в 1,5 ml Eppendorf епруветка, съдържаща 250 μl от гореспоменатия натриев фосфатен буфер, завихрят се и се въртят при 10 000 g за 10 минути. Количество 600 μl супернатант се поставя в NMR епруветка.

1Н NMR спектроскопия

1 H NMR спектри на проби от урина и фекални водни екстракти бяха получени с помощта на спектрометър Bruker 600 MHz (Bruker, Rheinstetten, Германия) при работна 1 H честота от 600.13 MHz при температура 300 К. NMR импулсна последователност (забавяне на рециклирането - 90 ° - t 1 -90 ° - tm -90 ° -придобиване) и стандартни параметри бяха използвани за получаване на стандартни едномерни 1Н NMR спектрални данни, както е описано в Beckonert et al. 67

Анализ на многовариантни статистически данни

Генериране на метаболитна реакционна мрежа

Използвайки свободно достъпния софтуер MetaboNetworks 19 са идентифицирани реакции, които протичат спонтанно или с помощта на ензими, свързани с човешки и/или бактериални геноми в KEGG. Всички пълни геномни последователности, изброени в KEGG, които биха могли да бъдат свързани с бактериалните групи, представени на HITChip, бяха включени в създаването на базата данни, което доведе до общо 817 бактериални генома, включени в базата данни. След това софтуерът е използван за изграждане на мрежа от метаболитни реакции с най-кратък път между всички (фекални и пикочни) метаболити, значително различни при всяко от различните диетични сравнения. От тази „глобална мрежа“ бяха генерирани две подграфи за всеки от двата диетични превключвателя, използващи значително свързани фекални метаболити. За да се подчертае диференциалната експресия на метаболитите, свързани със специфични пътища, фоновото засенчване беше добавено към графиките, за да посочи различните взаимосвързващи пътища (Фиг. 5а - в). Съкращенията и пълните имена на тези метаболити могат да бъдат намерени в допълнителна таблица 11.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителна информация

Допълнителни фигури 1-6, допълнителни таблици 1-11, допълнителни дискусии, допълнителни методи и допълнителни справки

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.