елементи

абстрактно

При жените зародишните клетки се поддържат в овариални структури, наречени първични фоликули. Броят на първичните фоликули в яйчниковия резерв е решаващ фактор за плодовитостта. Въпреки това значение липсват познания за точните физиологични механизми, които регулират броя на праисторическите фоликули. В това проучване ние показваме, че по време на прехода към зряла възраст мишките изпитват вълна от изчерпване на първичните фоликули. Ние показахме, че тази внезапна и драматична загуба на първични фоликули се задейства хормонално и идентифицира само апопоптичния протеин BH3, BCL-2 модифициращ фактор (BMF), който е от съществено значение за този процес, което предполага вътрешен апоптотичен път като ключов механизъм . Елиминирането на първичните фоликули по време на пубертета е не само забележително събитие в развитието, но е и физиологично важно, тъй като в крайна сметка намалява наличието на първични фоликули и определя продължителността на плодовитостта. Взети заедно, тези открития показват, че пубертетът е критичен прозорец за развитие за регулиране на размера на яйчниковия резерв, който влияе върху плодовитостта на жените и репродуктивното дълголетие.

Основното

Овариалният резерв от нерастящи първични фоликули представлява цялото снабдяване с яйцеклетки, които са на разположение на жените за подпомагане на плодовитостта по време на репродуктивния живот. Повечето първични фоликули съществуват в неактивно състояние, но няколко се активират, за да започне процесът на фоликулогенеза. Фоликулогенезата в крайна сметка завършва с фоликуларна атрезия или по-рядко завършва с овулация на зрял ооцит. Непрекъснатото навлизане на първични фоликули във все по-голям фоликул води до постепенно изчерпване на яйчниковия резерв с напредване на възрастта на жените, като безплодието настъпва, когато броят на фоликулите падне под критичния праг. Запасът от първични фоликули може да бъде изчерпан преждевременно от агенти, които индуцират генотоксичен стрес (напр. Много противоракови лекарства и радиация), което води до апоптоза на ооцитите и фоликуларна атрезия. 3, 4 Въпреки това, до каква степен апоптозата, регулирана от развитието, за разлика от апоптозата, индуцирана в резултат на излагане на специфични екзогенни стимули, пряко допринася за нормалния постнатален спад в първичните фоликули е по-малко ясна и факторите, влияещи върху времето на безплодие, свързано с майчиното остаряването остава зле характеризирано.

Многобройни проучвания документират числено намаляване на първичните фоликули след раждането. 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Едно такова проучване при мишки показа, че първоначалният яйчников резерв на първичните фоликули е изчерпан с повече от две трети между постнаталния ден (PN) 6 и 45. 8 След PN45, когато мишките се считат за полово зрели, първичните фоликули са изчезнали от яйчниковия резерв много постепенно. Въз основа на тези данни и приемайки постоянна скорост на загуба, проучванията на математическо моделиране са изчислили, че приблизително 80 първични фоликула се активират всеки ден, за да станат първични фоликули, и

150 първични фоликула претърпяват атрезия всеки ден в младежкия яйчник. По този начин има доказателства, които предполагат, че апоптозата, водеща до фоликуларна атрофия, може значително да допринесе за намаляване на размера на яйчниковия резерв след раждането, поне при много млади мишки. Концепцията обаче, че голям брой фоликули могат да бъдат загубени по време на важни събития за развитието след раждането, не е изследвана. По-специално, броят на първоначалните фоликули и динамиката по време на пубертета при мишки не са проучени и молекулните механизми, лежащи в основата на загубата на постнаталния първичен фоликул, остават непостоянни.

резултатът

Овариалният резерв от първични фоликули се изчерпва в BMF-зависим процес при мишки между PN40 и PN50.

Фоликулите бяха преброени в яйчниците на WT и Bmf -/- мишки при PN20, 30, 40 и 50, което надвишава периода от време, през който женските мишки преминават от млади в полово зрели възрастни (Фигури 1а до f). Този преходен период се нарича пубертет. Броят на първичните фоликули е подобен в яйчниците на WT и Bmf -/- мишки при PN20, 30 и 40 и остава относително постоянен през това време (Фигури 1а и д, Допълнителни таблици 1 и 2). Забележително е, че броят на първичните фоликули е намалял значително между PN40 и PN50 в яйчниците на жени с WT (Фигура 1а), но остава увеличен в яйчниците на Bmf -/- жени, което показва решаваща роля за BMF при това изчерпване (Фигура 1а, Приложение Таблици 1 и 2). Намаляването на броя на първичните фоликули в WT яйчниците между PN40 и PN50 не е свързано със съпътстващо увеличение на броя на първичните, вторичните или аналните фоликули, т.е. нарастващите фоликули (Фигури 1а - в), и е имало цялостна мрежа загуба на броя на фоликулите (Фигура 1г). Тези данни предполагат, че изчерпването на яйчниковия резерв не се дължи на повишена скорост на първоначално активиране на фоликула и преход към нарастващ фоликулен басейн. Вместо това тези наблюдения са в съответствие с хипотезата, че приблизително 50% от яйчниковия резерв (

1800 първични фоликула) се губят директно през този 10-дневен период от BMF-зависима атрофия. Драматичната загуба на първични фоликули изглежда е ограничена до този относително кратък преходен период, тъй като предишните ни проучвания показват, че изчерпването на първичния резерв е много по-постепенно при възрастни мишки през останалата част от репродуктивния живот. Интересното е, че значително повече вторични и антрални фоликули присъстват при PN50 в яйчниците на Bmf -/- женски, отколкото WT мишки (Фигури 1в и f), което вероятно показва повишена преживяемост в тази популация на фоликули. Това последно наблюдение е в съответствие с критичната роля на BMF при вторична и антрална атрезия на фоликула, която вече описахме. 5

изчерпва

Изображение в пълен размер

Фоликуларна атрезия при юноши и възрастни WT и Bmf -/- женски мишки

Фоликуларна атрезия на яйчниците при WT и Bmf -/- мишки. Броят на атретичните фоликули се определя в яйчниците на WT и Bmf -/- мишки при PN20, 30 40 и 50 (n = 6/възраст/генотип). ( а ) Представителни изображения на атретични преантрални (вторични) и антрални фоликули в оцветени с PAS овариални участъци от WT и Bmf -/- мишки при PN50. Атретичните преантрални и антрални фоликули се характеризират с наличието на разграждащи се ооцити и/или пикнотични гранулозни клетки. Скала = 50 μm. ( б ) Представителни изображения на TUNEL-положителни атретични фоликули (кафяво оцветяване) във вторични фоликули в овариални секции от WT и Bmf -/- мишки при PN50. Скала = 50 μm. ( ° С ) Данните са изразени като средната стойност ± SEM # на P -/- спрямо WT женски във всяка възраст от P -/- женски на всяка възраст. Вижте допълнителни таблици 1 и 2 за статистическата значимост на всички двойни сравнения в рамките на генотип

Изображение в пълен размер

Пубертетен преход при WT и Bmf мишки -/-

Начало на пубертета при WT и Bmf -/- мишки. ( а ) Процентът на WT и Bmf -/- мишки с поне едно жълто тяло, присъстващо в яйчниците им, беше определен при PN20, 30, 40 и 50 (n = 6/възраст/генотип). Броят на анализираните мишки е показан над всяка колона. ( б ) Средният брой на жълтите тела, присъстващи на яйчник при WT и Bmf -/- мишки (в анализа са включени само мишки с поне едно жълто тяло) е определен в PN20, 30, 40 и 50. Данните са изразени като средно ± SEM (където n = 3 или повече). # P -/- спрямо WT при PN50 (двуточков несдвоен студентски t-тест). ( ° С ) Представителни изображения на оцветени с PAS овариални секции от WT и Bmf -/- мишки при PN20, 30, 40 и 50. Обозначението "CL" показва местоположението на всяко жълто тяло. Скала = 200 μm

Изображение в пълен размер

Загубата на фоликули по време на пубертета се предизвиква по-скоро хормонално, отколкото зависи от възрастта

Въпреки че не е ясно защо толкова голям брой фоликули се елиминират по това време на половото съзряване, две скорошни проучвания върху мишки може да предоставят известна информация. 33, 34 Тези изследвания предполагат, че в яйчниците има две популации от първични фоликули, които имат различни функционални роли. 33, 34 Първичните фоликули, които се образуват предимно във фоликуларната основа във феталния яйчник, се характеризират със своето положение в костния мозък и бързо активиране при раждането. Повечето от тези фоликули се губят/използват преди PN60 и допринасят главно за формирането на функционална полова зрялост и ендокринна цикличност. Кохортата от първични фоликули, секретирани от яйчниците по време на пубертета, която характеризираме в това проучване, може да принадлежи към тази първа популация. Втората популация от първични фоликули се формира малко по-късно в яйчника на плода, намира се в кората на яйчниците и е отговорна предимно за плодовитостта на възрастните. 33, 34 Взети заедно, тези данни предполагат, че съществуват функционални различия в първичните фоликули преди и след пубертета и че процесите на съзряване по време на юношеството, включително загуба на анормални фоликули и повишена способност за развитие на фоликули, могат да бъдат важни за формирането на напълно функционални фоликули. яйчник за възрастни.

Въпреки че броят на фоликулите, свързани с пубертета, не е изследван специално при момичета преди и след пубертета (и може да не е възможен поради ограничената наличност на подходящи тъканни проби), данните въз основа на възрастта предполагат, че броят на първичните фоликули намалява с приблизително един. наполовина по време на юношески/млад възрастен период при хора (на възраст 13-25 години), 1 подобно на това, което наблюдаваме в нашия модел на мишка. Напоследък е установено, че първичните популации на фоликули претърпяват морфологични и функционални промени с възрастта и пубертета при хората: 35 почти 20% от първичните фоликули в предпубертетни човешки яйчници са необичайни (дефинирани като фоликули с необичайно голям ооцит със слабо оцветени ядро) .които ненормални първични фоликули никога не са били наблюдавани в възрастни тъкани. Авторите предполагат, че първокачествените фоликули с ниско качество са елиминирани или предпочитано използвани преди въвеждането на овулацията в зряла възраст. Тези данни предполагат, че промените в яйчниците по време на пубертета надхвърлят цикличното набиране на антрални фоликули за овулация и включват промени в размера на яйчниковия резерв на първичните фоликули.

В обобщение установихме, че приблизително 50% от първичните фоликули се губят директно от яйчниковия резерв непосредствено преди зряла възраст в процес, който изисква проапоптотичния протеин BMF и се задейства от гонадотропин. Публикувахме пубертета като важен момент от развитието, през който яйчниковият резерв значително се изчерпва и, което е важно, вече показахме, че това намаляване на броя на фоликулите в крайна сметка намалява плодородния живот на жената. Нашата работа хвърля нова светлина върху механизмите за развитие, които регулират размера на яйчниковите резерви и определят броя на наличните фоликули за подпомагане на женското плодовитост. В допълнение, тези данни предоставят ново разбиране за това как се регулира овариалният резерв във времето, като показват, че вместо стабилна загуба на първични фоликули след раждането, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 36 е активна вълна на загуба на фоликули. задейства се в пубертета и води до бързо изчерпване на фоликуларния басейн.

Материали и методи

Bmf -/- мишки на фон C57BL/6 бяха описани по-горе. 13 мишки C57BL/6 (WT) и Bmf -/- бяха настанени в контролирано с висока температура бариерно устройство (Monash University ARL) със свободен достъп до мишки и вода и 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Всички процедури и експерименти с животни са извършени в съответствие с австралийския кодекс за грижа и употреба на животните на NHMRC и одобрени от Комитета по етика на животните в Monash.

Оценка на броя на здравите фоликули

За определяне на броя на фоликулите е използвана обективна стереология. Стереологията е призната за метод на най-добра практика за количествено определяне на клетките в тъканните секции. 37 Яйчници от WT и Bmf -/- мишки (PN20, 30, 40, 50, n = 6/възраст/генотип) бяха фиксирани в разтвора на Bouin, обработени с хидроксиетил метакрилатна смола (Technovit 7100; Kulzer and Co., Friedrichsdorf, Германия ) и след това серийно разпределени при 20 μm с микротом Leica RM2165 (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Германия). Секциите се оцветяват с периодат-Шиф киселина и хематоксилин. Методологията за стереологични номера на фоликулите беше описана подробно. 6, 38 Накратко, на микроскоп Olympus BX50 (Токио, Япония), използвахме обектив × 100 с маслено потапяне с фаза Autoscan (Autoscan Systems Pty Ltd, Мелбърн, VIC, Австралия), който беше контролиран от стереологичната система StereoInvestigator (версия 11.06.02, MBF Bioscience 2015, MicroBrightField, Inc., Williston, VT, USA). Всяка трета порция се брои и броят на фоликулите се определя чрез умножаване на броя на суровите ооцити, взети (Q -), и по трите фракции за вземане на проби (1/f1, 1/f2 и 1/f3). 38

Оценка на броя на атретичните фоликули

Броят на аретичните фоликули се отчита в последователни 20 μm гликометакрилатни секции през целия яйчник, като се използва методът за фракциониране/физическа дисекция, както е описано по-горе. Първичните, първичните и вторичните фоликули са класифицирани като атретични, ако съдържат дегенериран ооцит (посочен от неравномерно ускорена плазмена мембрана или фрагментиран зародишен везикул), или ако гранулозните клетки са фрагментирани или имат пикнотични слети ядра. Антралните фоликули се считат за атретични, ако повече от 10% от техните гранулозни клетки са апоптотични или ако съдържат дегенериращ ооцит.

Рейтинг на пубертета: числа на жълтите тела

Броят на жълтите тела се определя чрез директно преброяване на всеки шест последователни 20 μm гликометакрилатни участъци, съдържащи целия яйчник. Съседните секции бяха оценени, за да се гарантира, че всяко жълто тяло се брои само веднъж.

Потискане на пубертета

Антагонистът на гонадотропин-освобождаващия хормон Cetrorelix (Sigma, Castle Hill, NSW, Австралия, кат. № 5249) се използва за забавяне на пубертета при WT мишки, като се използват дневни дози, както е описано по-горе при гризачи. 39, 40, 41 Инжекции (0,1 ml) физиологичен разтвор или Cetrorelix (0,5 mg/kg телесно тегло/ден) са прилагани подкожно дневно в продължение на 25 дни (n = 6 мишки/група). Лечението е започнало преди началото на пубертета, който при женските мишки се проявява първо като вагинално отваряне, което се случва при приблизително PN28 +/− 2 в нашата миша колония. Следователно лечението започна при PN25 и продължи до края на експеримента при PN50. Всички животни се наблюдават ежедневно чрез визуална инспекция за вагинално отваряне. След като се наблюдава вагинално отваряне, ежедневно се събират вагинални тампони за проследяване на естерите.

Стимулиране с конски хорион гонадотропин и човешки хорион гонадотропин

PN20 полово незрели женски WT мишки са инжектирани с физиологичен разтвор (контроли) или конски хорион гонадотропин (eCG, 5IU), последван от 44-48 часа по-късно чрез инжектиране на човешки хорион гонадотропин (hCG, 5IU) (n = 6/група). В PN30 бяха събрани яйчниците и бяха преброени първичните фоликули.

TUNEL оцветяване

За откриване на апоптотични клетки в секции на яйчниците е използван комплект за откриване на апоптоза за откриване на апоптоза в дадена ситуация (Chemicon International, Мелбърн, Австралия) съгласно инструкциите на производителя. Апоптотичните клетки бяха визуализирани чрез добавяне на 0,05% DAB хромаген (Sigma, Castle Hill, NSW, Австралия) и срезовете бяха оцветени, използвайки чист харис хематоксилин. За всяко животно бяха оценени минимум три произволно избрани диапозитиви (n = 6). Положителните контроли бяха извършени чрез излагане на DNAseI препарати (съгласно инструкциите на комплекта). Един слайд беше използван на всеки слайд за TUNEL анализ, докато другият служи като отрицателна контрола (без добавяне на TdT).

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± SEM и е извършен статистически анализ на броя на фоликулите, използвайки софтуера GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Нормално разпределените данни бяха анализирани с помощта на студентски t-тест за двойни сравнения или еднопосочен ANOVA и значимостта беше определена чрез тест за множество сравнения на Tukeys. Разликите се смятаха за значими, когато P