абстрактно

Нарастващата роля на NHERF в клетъчната физиология. NHERF съдържа два тандема и силно хомоложни PDZ домейни (аминокиселини 11-97 представляват PDZ-I - диагонални ивици) и аминокиселини 150-237 от PDZ-II (модел на плочки), както и С-краен регион от приблизително 30 аминокиселини, се свързва с семейства членове на ERM на мембранно-цитоскелетни адаптери (пунктирана схема). Докато много клетъчни протеини свързват PDZ-I, е доказано, че няколко протеини свързват PDZ-II. NHE3 свързва региона, съдържащ се в PDZ-II и С-края. Точният характер на тази асоциация остава неизвестен. Трябва да се изследва връзката структура-функция за други NHERF цели, като например транспортьор Na/Pi тип IIA и котранспортер Na/HCO3. Метаболитното маркиране показва, че NHERF е фосфорилиран при серин-289 (показан като звезда)

ролята

Изображение в пълен размер

Развитие на ролята на NHERF в клетъчната физиология: от йонния транспорт до предаването на сигнала

NHERF, мембранно-цитоскелетен адаптер. Изследванията на регулацията на NHE3 в много лаборатории показват предварително образуван комплекс от NHE3 с NHERF и езрин, който свързва комплекса с актиновия цитоскелет под апикалните мембрани. Esrin също така позиционира PKA, за да фосфорилира едно или повече места (показани като звезди) в цитоплазмения край на NHE3, за да регулира транспортната активност и рециклирането на NHE3. Сигнали за растежен фактор, медиирани от малкия GTP-свързващ протеин, Rho, активират ROCK протеин киназата, която фосфорилира С-крайния сайт (показан като звезда) в езрин, превръщайки го от инертни разтворими димери във функционални мономерни адаптери, които се свързват и с двете NHERF и актин за регулиране, NHE3 и други цели

Изображение в пълен размер

По-късни проучвания идентифицират друга функция за свързването на NHERF с P2A, а именно да се определи съдбата на интернализирания рецептор по време на десенсибилизация, предизвикана от агонист (Cao et al., 1999). Данните предполагат, че свързаният с NH2F p2 AR е бил по-лесно рециклиран към клетъчната повърхност по време на ресенсибилизация. Въпреки това, NHERF асоциацията е нарушена от GRK-5 (G-протеин-свързана рецепторна киназна изоформа), медиирана от P2 AR фосфорилиране в С-крайния PDZ-свързващ мотив. Това доведе до пренасочване и разграждане на рецепторите в лизозомите. Тези проучвания показват, че както може да се види при NHE3, NHERF играе няколко роли в регулирането на сигнализирането на β-адренергичните рецептори.

NHERF, усилвател на сигнала за растежен фактор

NHERF, нова роля в сигнализирането на растежен фактор. Димеризацията и активирането на PDGF рецепторната тирозин киназа се улеснява или стабилизира чрез свързване с NHERF PDZ-I домейна. Способността на NHERF да образува хомодимери може да стимулира PDGFR активиране и да инициира митогенни сигнали чрез PI 3-киназа и MAP киназни пътища. По аналогичен начин, димерният NHERF може също така да улесни свързването на калциевия канал Trp4 с изоформите на Cp фосфолипаза, които и двете свързват NHERF PDZ-I, за регулиране на калциевия метаболизъм и фосфоинозит и активиране на сигналите на протеин киназа С, необходими за растежа на клетките.

Изображение в пълен размер

NHERF: насочване към нерецепторни тирозин кинази

По време на десенсибилизация на p2 AR, нерецепторна тирозин киназа, c-Src, се включва в рецепторния комплекс. Β-арестин, фосфопротеинов модулатор на P2B сигнализиране, и активиран c-Src са необходими за образуване на покрити с клатрин ямки, които насърчават β2 AR ендоцитоза (Ahn et al., 1999). Набирането на c-Src също предизвиква активиране на ERK, индуцирано от β-агонист, и инициира митогенна сигнализация. Тъй като NHERF селективно се асоциира с клъстериран p2 AR (ref), може да има кръстосани връзки между NHERF и β-арестин, който също така свързва цитоплазмената опашка на p2 AR по зависим от агониста начин, за да контролира интернализацията и флуктуацията. P2 AR и модулират c-Src медиирани сигнали, които регулират клетъчния растеж.

NHERF и фосфоинозитид метаболизъм

Последните наблюдения, че PDZ-II в NHERF-2/E3KARP свързват фосфолипаза Cp3 и усилват нейната активност в множество клетъчни линии, предполагат важна роля за NHERF в сигнализирането на фосфоинозитид (Hwang et al., 2000). Фосфолипазата Cp3 разцепва PIP 2 на две ключови сигнални молекули, диацилглицерол и IP3. Последващото активиране на свързания с ендоплазматичния ретикулум IP3 рецептор мобилизира вътреклетъчни запаси от Ca 2+, които заедно с диацилглицерола активират протеин киназа С и улесняват митогенната сигнализация. Увеличаването на вътреклетъчния калций или калциевия връх от своя страна инициира притока на извънклетъчен Ca 2+ през калциевите канали (SOC), които се съхраняват в резервоарите, върху плазмената мембрана и запълва изтощените вътрешни резервоари. По този начин SOC играят важна роля в регулирането на вътреклетъчния калций. Неотдавнашен доклад предполага, че NHERF-1 PDZ-I се свързва с две SOC на бозайници, Trp4 и Trp5, както и фосфолипази Cpl и Cp2 (Tang et al., 2000). Тъй като SOC и PLCβ съжителстват в комплекс с NHERF, той предполага, че NHERF може да комбинира функциите на SOC с PLCp (Фигура 3), за да координира метаболизма на калция и фосфоинозитида и да контролира клетъчния метаболизъм и растеж.

NHERF, основната цел на ERM протеините

Човешкият NHERF е изолиран като EBP-50 или езрин свързващ протеин от приблизително 50 000 Mr (Reczek et al., 1997) и свързва повечето членове на семейството на ERM от цитоскелетните протеини, които свързват мембранните протеини с основния актинов цитоскелет. ERM протеините също така дефинират структурите на плазмената мембрана, като микровили, разположени върху апикалната повърхност на поляризирани епителни клетки. Много клетки съдържат неактивни хомо- и хетеродимери на есрин, свързани с други ERM протеини, които не са в състояние да се свържат нито с NHERF, нито с F-актин (Nguyen et al., 2001). Въпреки това, растежните фактори насърчават фосфорилирането на С-крайния остатък в езрин (и мизин) чрез PKC0 или активирана от RhoA протеин киназа, ROCK и активират езрин, превръщайки го в мономерна форма, която лесно се свързва с NHERF Bretscher, 1999). По този начин е интересно да се отбележи, че Rho, но не тясно свързани малки GTP-свързващи протеини, Rac1 или Cdc42, регулира активността на NHE3, вероятно чрез увеличаване на наличността на ERM протеини чрез увеличаване на тяхното фосфорилиране от ROCK (Szaszi et al., 2000).

Merlin, член на семейството на ERM адаптер протеин и продукт на гена за неврофиброматоза 2 (NF2), е пряко свързан с регулирането на растежа. NF2 е широко мутирал в доминиращо наследствено заболяване, което предразполага пациентите към шваноми и менингиоми (Stokowski and Cox, 2000). Човешките мутации NF2 са свързани с тежка заболеваемост, която намалява продължителността на живота на засегнатите индивиди до по-малко от 40 години. Merlin, подобно на други ERM протеини, се свързва с NHERF чрез своя N-краен ERM домейн. Повече от 80% от болестотворните мутации, открити в ERM домейна, водят до значително по-нисък афинитет на мутантните протеини на мерлин към NHERF и предполагат, че NHERF играе ключова роля в туморната супресорна активност на мерлин.

Esrin също играе разрешителна роля в ROCK-медиираната трансформация на фибробластите от онкогените Net и Dbl (Tran Quang et al., 2000). Net и Dbl са и двата фактора за обмен на гуанин нуклеотиди, които насърчават GTP натоварване и Rho активиране. Онкогенните или хиперактивирани форми на Net и Dbl водят до натрупване на активиран Rho и увеличаване на Rho-трансдуцираните пролиферативни сигнали. Ефектите, стимулиращи растежа на Rho-GTP, също изискват С-терминално фосфорилиране и активиране на езрин, а мутантният езрин, който няма критично място за фосфорилиране, потиска клетъчната трансформация от онкогени на Net и Dbl.

Esrin също е свръхекспресиран и силно фосфорилиран в cFos-трансформирани фибробласти (Lamb et al., 1997). В допълнение, свръхекспресията и фосфорилирането на езрин са свързани с променената клетъчна форма и подвижност, което вероятно отразява повишените инвазивни свойства на злокачествените клетки. Асистираната с хромофор лазерна инактивация (CALI) на есрин води до ретракция на псевдоподиални издатини с акцент върху ролята му в миграцията на клетките (Jay and Sakurai, 1999). Други ERM протеини, като радиксин и мизин, се регулират надолу при белодробен аденокарцином в сравнение с нормалната белодробна тъкан (Tokunou et al., 2000). И накрая, нов член на семейството на ERM, Ehm2, е силно експресиран в клетки на меланоми на мишки (Shimizu et al., 2000). Тези проучвания показват, че промените в клетъчния профил на ERM протеините и тяхната асоциация с NHERF, основна цел на ERM протеините в епителните клетки, могат да насърчат трансдукцията на сигнали, които контролират клетъчния растеж и трансформация.

NHERF и рак на човека

NHERF наскоро беше идентифициран като иРНК, която е силно индуцирана от естроген в естрогенните рецепторни (ER) положителни ракови клетки на гърдата (Ediger et al., 1999; Stemmer-Rachamimov et al., 2001). Естрогенът повишава нивата на NHERF иРНК и протеини в ER (+) MCF7 клетки. За разлика от това, експресията на естрогенния рецептор в ER (-) клетки възстановява способността на естрогена да индуцира експресията на NHERF в тези клетки. Тези и други експерименти определят NHERF като естроген-индуцируем ген. Въпреки това, директният анализ на мишия NHERF ген не успява да идентифицира естроген-реагиращия елемент (и) и механизмът за регулиране на NHERF от естроген остава неизвестен (Weinman et al., 1999).

Широкият анализ на човешки ER (+) и ER (-) ракови клетки на гърдата допълнително засили връзката между експресията на NHERF и естроген-зависимия растеж при първични ракови заболявания на гърдата (Stemmer-Rachamimov et al., 2001). Имунохистохимичните проучвания показват, че експресията на NHERF е увеличена при тумори на гърдата в сравнение със съседната нормална гръдна тъкан, като по този начин се насърчава ролята на NHERF в развитието на тумора. В това отношение PDGF сигналите се усилват при рака на гърдата при човека и участват в прогресията на тумора (Shao et al., 2000). Поради предложената роля на NHERF-1 и NHERF-2 за насърчаване на димеризацията на PDGFR и активиране на митогенни сигнали, повишената експресия на NHERF може да бъде фактор, допринасящ за клетъчната пролиферация при по-злокачествени форми на рак на гърдата. И накрая, човешкият ген NHERF е разположен в хромозома 17q25.1, регион, който често е мутиран при рак на гърдата и яйчниците при човека (GenBank access # NM_004252; Kalikin et al., 1996, 1997). Недостатъците в експресията на NHERF могат също да доведат до нарушения в сигнализирането за растеж и да доведат до рак на човека.

Промените в обмена на Na +/H + играят роля в псевдоподиалната пролиферация на туморни клетки (Lagana et al., 2000) и клетъчната пролиферация. NHE3, която е преобладаващата изоформа на NHE в епителните клетки, може да действа заедно с NHERF за регулиране на пролиферацията и инвазивната способност на рака на гърдата, яйчниците и стомашно-чревния тракт.

Заключителни бележки

През последните години беше постигнат значителен напредък в разширяването на ролята на NHERF в много аспекти на биологията на епителните клетки. Нарастващите доказателства също сочат към променена експресия на NHERF и/или функция при човешки заболявания, включително хипертония, остра бъбречна недостатъчност и рак на гърдата. Въпреки това, много от биохимичните свойства на NHERF, като изброените по-долу, все още са слабо разбрани.

Регулиране на димеризацията на NHERF

Съдържанието на NHERF в бъбречната тъкан далеч надвишава съдържанието на известните му цели и въпреки че броят на NHERF целите продължава да расте, все още има сериозни въпроси относно наличността на всички клетъчни NHERF за целите му. Естествената тенденция на NHERF да образува димери може да даде допълнителни индикации за неговата физиологична регулация. Докато новите доказателства сочат, че димерният NHERF действа за регулиране на някои цели, като CFTR (Ahn et al., 2001) и PDGFR (Maudsley et al., 2000), други функции, включително регулирането на NHE3, могат да използват мономерен NHERF. Последните проучвания показват, че димеризацията на NHERF може да се регулира чрез протеиново фосфорилиране, тъй като лечението на клетки с окадаинова киселина, протеинов серин/треонин фосфатазен инхибитор и мощен туморен промотор силно намалява димеризацията на NHERF (Shenolikar et al., 2001). Физиологичните механизми, които регулират димеризацията на NHERF, също могат да играят важна роля в диктуването на наличността и функцията на NHERF в епителните клетки.

Ролята на фосфорилирането на NHERF

Проучванията за метаболитно маркиране показват, че NHERF е фосфопротеин в клетки на бозайници (Weinman et al., 1995). Hall et al. (1999) показват, че GRK6A, G-протеин, свързана рецепторна киназна изоформа, е основна NHERF киназа в клетки HEK293. Интересното е, че GRK6A се свързва с NHERF PDZ-I (и PDZ-II) за насърчаване на фосфорилирането на NHERF. Въпреки това, клетъчните сигнали, които модулират поглъщането на GRK6A и фосфорилирането на NHERF или ролята на ковалентната модификация при серин-289 (Фигура 1) за функцията на NHERF, са неизвестни.

Състезание между целите на NHERF

Експериментални доказателства показват, че p2 AR (Hall et al., 1998b) и CFTR (Ahn et al., 2001) свързват PDZ-I, но все пак се конкурират с NHE3, който за предпочитане се свързва с PDZ-II и С-края на NHERF и по този начин увеличава обмена Na +/H +. Тъй като броят на целите на NHERF се увеличава, трябва да се проучи потенциалната роля на конкуренцията между целите на NHERF, а именно тези, включващи PDZ-I или PDZ-II, и физиологични сигнали, които променят афинитета на NHERF към определени клетъчни цели, пренасочвайки функциите му .

В обобщение, последните проучвания показват, че NHERF регулира множество сигнални пътища, които участват в растежа и функцията на епителните клетки. В допълнение, новите данни сочат NHERF като фактор, допринасящ за развитието на човешкия рак. Предизвикателството за бъдещи проучвания ще бъде да се определят медиираните от NHERF събития, които са от съществено значение за нормалната клетъчна физиология и да се изясни ефектът на аберантна експресия на NHERF и функцията при трансформация на епителните клетки.

Благодаря

Изследванията на NHERF в лабораториите Weinman и Shenolikar се подкрепят от безвъзмездни средства от NIH DK55881 (EJ Weinman и S Shenolikar) и доклади за ветераните (EJ Weinman). JW Voltz се подкрепя от хищническа общност от Министерството на отбраната срещу рака на гърдата (DAMD-17-98-1-8070).