недостиг

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Гестационният MDD променя морфометричните свойства и свойствата на мозъка на плъховете
  • MDD намалява мозъчната експресия и фосфорилирането на Stat3
  • MDD влияе върху експресията на протеин кинази с активен ключ
  • Намалената сигнализация на Stat3 е свързана с повишена апоптоза и съпътстваща променена експресия на свързани протеини in vivo aj инвитро
  • Намалената сигнализация на Stat3 е свързана с повишена експресия на miR-124 в мозъка
  • Заглушаването на miR-124 подобрява сигнализирането на Stat3 и поне частично спасява клетки, изложени на дефицит на фолиева киселина
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Допълнителна фигура 2
  • Допълнителна фигура 3
  • Допълнителна фигура 4
  • Word документи
  • Допълнителна легенда на изображението
  • Терминологичен речник

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • Развитие на нервната система
  • ДНК метилиране
  • miRNA

абстрактно

Основното

В експериментални проучвания липсата на донори на метил като фолат и В12 е свързана с небалансирана пролиферация/диференциация на невронални клетки, стрес от ендоплазмен ретикулум и апоптоза. 11, 12, 13, 14, 15 Освен това при гризачи се съобщава за хипокампална атрофия, рядкост на микроваскулатурата и когнитивно увреждане. 12, 16, 17 Въпреки че е доказано, че хомоцистеинът е ембриотоксичен, изглежда не е пряко отговорен за нарушения в развитието, 18, 19 и механизмите, залегнали в ефекта на състоянието на майчиния витамин В върху нервната тръба и развитието на мозъка остават слабо разбрано.

Развитието на ембриофетален мозък е много сложен процес, който изисква времевата експресия на специфични генни набори с редица точно организирани стъпки. 20 За да определим как генетичната регулация на факторите за невроразвитие може да бъде отговорна за мозъчни дефекти, свързани с изчерпване на фолат/витамин В12, използвахме подход с микрочипове (неврогенеза на плъхове на плъхове и PCR Array на невронни стволови клетки, RT 2 Profiler PCR Array, SABiosciences, Qiagen SA. ). Тъй като сигналният преобразувател и активаторът на транскрипция 3 (Stat3) се появиха като единичен ген, силно намален за дефицит на витамин В, ние допълнително проучихме участието му в последиците от MDD in vivo в валидиран модел от 12, 17 и in vitro хипокампален предшественик на плъхове . 14.

Stat3, свързан предимно със сигнали, свързани с цитокини и растежни фактори, се активира чрез фосфорилиране и регулира транскрипцията на целеви гени, които участват в много физиологични реакции. В действителност, Stat3 е многократно замесен в основни биологични процеси като клетъчна пролиферация, диференциация, апоптоза и оцеляване, 22, 23 и е доказано, че участва в различни събития в развитието като свързване и проводимост на моторните неврони 24 и израстване на неврити., 25 Ето първите доказателства, че ранното MDD причинява загуба на сигнализиране Stat3, свързано с свръхекспресия на miR-124, с нарушено мозъчно развитие.

резултатът

Предишни in vivo и in vitro проучвания демонстрират ефикасността на нашите експериментални условия за намаляване на наличността на метил донор при потомството на плъхове 12, 26 и в хипокампалните H19-7 клетки. 14 И при двата експериментални модела глобалното метилиране на ДНК е намалено при условията на експеримента с нисък метилов алкохол, т.е. с 23,2% в мозъчната тъкан на плода (n = 4) и с 40,4% в култивираните хипокампални клетки 13 часа след индуцирането на тяхната диференциация ( n = 4).

Гестационният MDD променя морфометричните свойства и свойствата на мозъка на плъховете

Както е показано на Фигура 1, телесното тегло и телесната дължина са значително намалени по време на късна бременност (ембрионален ден 20, E20) (-20,5% и -15%) при плодове на плъхове, хранени с диета с ниско съдържание на храна, което показва появата на вътрематочно забавяне растеж. Това се потвърждава от значително намаляване на дължината на бедрената кост (-14%). Докато теглото на мозъка също е било засегнато (-14,6%), дебелината на селективните мозъчни слоеве, като хипокампалния пирамидален слой CA1, клетъчният слой на зъбната гирусна гранула и неврогенната субвентрикуларна зона (-40, -22% и -26 %). Най-интересното обаче е, че тези области на мозъка остават атрофирани на възраст 450 дни, въпреки че малките плъхове получават само стандартна, дефицитна диета от отбиването (Фигури 1e-h).

Ефекти на недостига на метил донор върху морфометричните свойства на плода на плъх. а - г ) Общи морфометрични измервания при контролни и MDD фетуси в деня на ембриона (ED) 20, 33≤ n ≤37. Данните са представени като средно ± SD Статистически значими разлики между контролните и MDD плъховете: ** P 705 и phospho-Stat3 Ser 727 (Фигура 2b). Количествените промени в нивата на протеин са показани в допълнителната информация (Допълнителна фигура 1). Според нашите Western blot анализи, общото количество протеин Stat3 е намалено с 62% в лишения от плод среден мозък. Както е показано на Фигура 2в за фосфо-Stat3 Tyr 705, такива наблюдения са потвърдени чрез in situ имунохистохимия в мозъчната кора, в SVZ и в CA1 слоя на хипокампуса.

Ефекти на недостига на метил донор върху мозъчната експресия на Stat3 и фосфо-Stat3 (Tyr 705 и Ser 727) при плодове на плъхове при Е20. а ) Общо Stat3 нива на иРНК, измерени чрез количествена RT-PCR в реално време. Данните се отчитат в произволни единици (AU) като средна стойност ± SD (n = 5), * P 705 и фосфо-Stat3 Ser 727 в средния мозък и кората от контролните плодове (C) и MDD E20. Подобни профили са получени от други пет експеримента. ° С ) Имунохистохимично оцветяване на Stat3 и фосфо-Stat3 Tyr 705 в мозъчната кора, SVZ и хипокампалния слой на CA1 от контролни и MDD E20 плодове

Изображение в пълен размер

Подобни открития са получени в култивирани хипокампални прогениторни клетки с намалени нива на иРНК (-54%) и експресия на протеин 6 и 13 часа след индуциране на диференциация в клетки без фолат (Фигура 3 и Допълнителна Фигура 1). Количеството на общия протеин Stat3 намалява с 48% 13 часа след индукция на клетъчна диференциация. В допълнение, имуноцитохимичните анализи чрез конфокална микроскопия разкриват видимо намаляване на присъствието на Stat3 в клетъчните ядра (Фигура 3в).

Ефекти на дефицита на фолиева киселина върху експресията на Stat3 и фосфо-Stat3 (Tyr 705 и Ser 727) в H19-7 хипокампални прогениторни клетки. а ) Общи нива на Stat3 mRNA, измерени чрез количествена RT-PCR в реално време в контролни и B9-дефицитни клетки 13 часа след индукция на тяхната диференциация. Данните се отчитат в AU като средна стойност ± SD (n = 5), * P 705 и фосфо-Stat3 Ser 727 в контролни (C) и B9-дефицитни (D) H19-7 клетки 6 и 13 часа след индукция на диференциация. са получени от други пет експеримента. ° С ) Имуноцитохимично маркиране на Stat3, фосфо-Stat3 Tyr 705 и фосфо-Stat3 Ser 727 в контролни клетки и дефицитни на B9 H19-7 клетки 13 часа след индукция на тяхната диференциация

Изображение в пълен размер

MDD влияе върху експресията на протеин кинази с активен ключ

Stat3 сигналните пътища изискват няколко кинази, като Erk1/2 MAP кинази, p38, c-Jun N-терминална киназа (JNK) и Src, които участват в димеризацията и активирането на Stat3. 27, 28

След експозиция на MDD, моделите на експресия на активните фосфорилирани форми на съответните кинази бяха засегнати по различен начин (Фигура 4). Експресионните нива на фосфо-Erk1/2, фосфо-Src и фосфо-р38 намаляват значително, докато експресията на фосфо-JNK се увеличава и експресията на фосфо-Акт не се променя значително. Важно е, че регистрираните профили са сходни в мозъчната тъкан на плода и в диференциацията на клетки H19-7. Количествените промени в количеството протеин са дадени в допълнителната информация (допълнителна фигура 2).

Western blot анализ на фосфокинази нагоре по веригата, участващи в сигналните пътища на Stat3 в мозъчната кора на контролните (C) и MDD E20 плодове и в контролните (C) и B9-дефицитни (D) H19-7 клетки на 6 и 13 часа след индукцията на тяхната диференциация. Подобни профили са получени от други пет експеримента

Изображение в пълен размер

Намалената сигнализация на Stat3 е свързана с повишена апоптоза и съпътстваща променена експресия на свързани протеини in vivo и in vitro

Известно е, че активирането на Stat3 влияе положително върху експресията на антиапоптотични и Bcl-2 и Bcl-xL протеини за оцеляване. 29, 30 Следователно ние изследвахме нивата на тяхната експресия, както и нивата на други ключови фактори в апоптозата след MDD.

Както се очаква, количеството Bcl-2 и Bcl-xL намалява значително в мозъка на плодовете E20, хранени с лоша диета, докато нивата на експресия на проапоптотичните протеини Bax и разцепената каспаза-3 се увеличават както в средния мозък, така и в мозъка. кора, разцепена каспаза-9 е свръхекспресирана само в средата на мозъка (Фигура 5а). Количествените промени в количеството протеин са дадени в допълнителната информация (допълнителна фигура 2). В допълнение, броят на TUNEL-положителните клетки в хипокампуса, SVZ и мозъчната кора на дефицитни плодове е значително увеличен (Фигура 5в, Допълнителна Фигура 3). Това беше потвърдено чрез маркиране на активна каспаза-3 и каспаза-9 в мозъка на плода, както е показано в хипокампалната област на CA1 и в SVZ, с наличието на голям брой мъртви клетки в страничната камера (Допълнителна фигура 3 ).,

В проучване, използващо TaqMan RT-qPCR, моделите на експресия на nRNK на miR-124a показват значително увеличение (двукратно) в мозъка на изложени на MDD плодове E20, както и на B9-дефицитни H19-7 невропрогенитори 13 часа след индукция. тяхната диференциация (1,7 пъти) (фигури 6а). Това беше потвърдено чрез in situ хибридизация in vivo в различни мозъчни региони, включително хипокампуса, SVZ (Фигура 6в) и малкия мозък (не е показан) и in vitro в клетки за диференциация (Фигура 6d).

Ефекти на недостига на метил донор върху експресията на miR-124. а ) Нива на експресия на miR-124 в AU в мозъка на контролните и E20 плодове с дефицит. ( б ) Нива на експресия в контролни (C) и B9-дефицитни (D) H19-7 клетки 13 часа след индукция на тяхната диференциация. Всички данни се отчитат като средна стойност ± SD (n = 9 и n = 7 за мозъчна тъкан E20 и култивирани клетки H19-7), * P ** P

Ефекти на miR-124 заглушаването върху H19-7 клетъчна диференциация. ( а ) Ефекти на miR-124 siRNA върху нивата на експресия на Stat3 и свързаните с тях протеини в контролни (C) и дефицитни на фолат (D) клетки 13 часа след индукция на диференциация (si = нецелена siRNA, siM = miR-124-насочена siRNA) . Експресионните модели са представителни за три отделни серии от уестърн петна. ( б ) Ефект на miR-124 siRNA върху клетъчната морфология 13 часа след индукция на диференциация. ( ° С ) Процент апоптотични клетки, както е показано от анализа TUNEL. д ) Брой клетъчни процеси на клетка. За ( ° С ) а ( д ): статистически значима разлика с подходящ контрол: * P •• P 14 В това проучване понижаването на регулирането на miR-124 siRNA доведе до значително подновяване на тези процеси. Въпреки че лечението с miR-124 siRNA леко повлиява характеристиките на клетките в контролните предшественици, броят на невритите на клетка е увеличен ∼-пъти в клетки с дефицит на фолиева киселина, третирани с miR-124 siRNA в сравнение с клетки, третирани с ненацелена siRNA (Фигури 7d, P

Обобщение на основните събития, свързани с последиците от MDD в мозъка на плъхове. Моля, обърнете внимание, че предоставяме първите доказателства за понижаване на регулирането от miR-124 за активността на Src, което представлява фосфорилирането на Stat3 при остатък Tyr 705.

Изображение в пълен размер

Директните ефекти на MDD върху единичния въглероден метаболизъм и различните му ключови фактори в животински модел, както и ефектите от дефицита на фолиева киселина върху култивираните H19-7 хипокампални предшественици са описани подробно в предишни доклади. 12, 14, 26 Такова лечение води по-специално до натрупване на хомоцистеин и намаляване на клетъчния индекс на метилираща способност, съответстващ на съотношението SAM/SAH. Това е отразено в нашето проучване, по-специално в намаляването на количеството метилирана ДНК в отговор на MDD в двата ни експериментални модела.

Изненадващо, докато лечението с siR miR-124a siRNA леко намалява броя на невритите в контролните клетки, то значително подобрява морфологията на клетките при дефицитни прародители.

Въпреки че точните механизми, чрез които състоянието на витамин В може да повлияе на експресията на miR-124, все още са напълно изяснени, съществуването на връзка между фолат и miR е документирано по-рано. Добавянето на фолиева киселина ще има благоприятен ефект върху индуцираната от етанол тератогенеза в мозъка на плода чрез частично намаляване на регулацията на miR-10a, 43 докато експресията на различни miRs в развиващия се мозък на мутантния миши модел на нервна тръба (Splotch -/- ) е променен от добавки с фолиева киселина. 44 Накрая, Marsit et al. 45 показва, че дефицитът на фолиева киселина причинява значително увеличение на профилите на експресия на няколко miRs в култивирани човешки лимфобластоидни клетки. Намаленият статус на фолиева киселина/витамин В12 води до намалена наличност на SAM, което е необходимо за реакциите на клетъчно метилиране. Документирано е, че MiRs се регулират от епигенетични събития и наскоро беше демонстрирано метилиране-медиирано заглушаване на гените miR-124. 47 Следователно променената експресия на miR-124 може да бъде свързана с доставка на донори с ниска метилова група, заедно с намалено ДНК метилиране, както се наблюдава в нашите модели, и в крайна сметка да доведе до промени в експресията на Stat3.

В заключение показахме, че MDD е свързано с повишена експресия на miR-124, което засяга сигнализирането на Stat3 на две различни нива; първо на нивото на експресия чрез насочване на Stat3 иРНК и второ чрез насочване към нейното активиране чрез инхибиране на Erk1/2 и Src кинази, без ефектите на miR-124 върху други кинази, участващи в сигнализирането на Stat3. Мозъкът е много уязвим по време на развитието и нарушената сигнализация на Stat3 може да доведе до намалена клетъчна пролиферация и повишена апоптоза, което може да доведе до окончателна атрофия на специфични мозъчни слоеве, както се наблюдава при плъхове с дефицит на витамин В.