чревното

  • елементи
  • абстрактно
  • ВЪВЕДЕНИЕ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • Специфичната за Т-клетките загуба на PTPN2 изостря чревното възпаление
  • Загубата на PTPN2 води до променени преобразуватели на сигнали и активатори на транскрипционно (STAT) фосфорилиране и експресия на фактор на транскрипция на Т-клетките.
  • Повишени нива на Th1 и Th17 клетки в дебелото черво, MLN и далака на мишки с дефицит на PTPN2
  • Загубата на PTPN2 в Т-клетките води до инфилтрация на Т-лимфоцити в органи извън червата и автоимунни реакции
  • Загубата на PTPN2 предизвиква чревна дисбиоза
  • Наличието на CD-асоцииран вариант на PTPN2 води до повишена генна експресия, свързана с Th1 и Th17 при чревни биопсии на пациенти с IBD.
  • ДИСКУСИЯ
  • методи
  • Индукция на мишки и колит
  • Оценка на тежестта на колита и хистологичен резултат
  • Инвитро Th-клетъчна диференциация
  • Анализ на микробиота
  • Пациентски проби
  • Статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителни изображения
  • Word документи
  • Допълнителни фигури Легенди и методи

елементи

  • болест на Крон
  • дисбиоза
  • Имунология на лигавицата
  • Т клетки

абстрактно

Регулирането на диференциацията на Т-клетките помощници (Th) в популациите на ефекторни Т-клетки е от съществено значение за поддържане на толерантност към собствени антигени, както и към безвредни несамогенни антигени, като тези, получени от хранителни частици или коменсални бактерии в червата и върху кожа. 1, 2 При болестта на Crohn (CD) е описана форма на хронично чревно възпаление, повишени нива на класическия Th1-цитокин IFN-γ, както и Th17-цитокините IL-17A/F и IL-22 в червата. биопсия и серум, 3, 4, 5, 6, което предполага неравномерна пролиферация на Th-клетки като механизъм за управление на заболяването. Чрез секретиране на специфични цитокини, Th клетките организират имунния отговор (напр. Класов преход от IgM към IgG/IgA 7 в чревни В клетки или повишена секреция на антимикробни пептиди от чревни епителни клетки) до коменсални и патогенни бактерии, като по този начин влияят върху състава на чревна флора. Промените в микробиотичния състав са свързани с чревни заболявания. 8

РЕЗУЛТАТИТЕ

Специфичната за Т-клетките загуба на PTPN2 изостря чревното възпаление

Загубата на PTPN2 води до променени преобразуватели на сигнали и активатори на транскрипционно (STAT) фосфорилиране и експресия на фактор на транскрипция на Т-клетките.

Изображение в пълен размер

  • Изтеглете слайд на PowerPoint

Повишени нива на Th1 и Th17 клетки в дебелото черво, MLN и далака на мишки с дефицит на PTPN2

Увеличената лимфоидна клетъчна инфилтрация и повишената тежест на колит, заедно с повишена активация на STAT1/STAT3 ни доведоха до решението, ако загубата на PTPN2 в Т клетките води до променена диференциация на Th-клетките. Не открихме разлика в съотношенията на CD8 + спрямо CD4 + Т клетки между PTPN2 fl/fl и PTPN2 fl/fl xCD4Cre мишки (данните не са показани).

Инжектирането на наивни CD4 + Т клетки в RAG -/- мишки доведе до силна индукция на IFN-y +, както и на IL-17 + клетки в чревната група на CD4 + Т клетки. Докато индукцията на IFN-y + клетки беше лека и индукцията на IL-17 + клетки беше ниска при мишки, получаващи Т-клетки, компетентни за PTPN2, инжектирането на наивни Т-клетки с дефицит на PTPN2 доведе до масивни нива на IFN-y + и индукция на IFN . -y/IL-17 двойно положителни CD4 + Т клетки (Фигура 3а). За разлика от тях, FoxP3 +/CD25 високорегулаторни Т клетки (Tregs) са силно индуцирани при мишки, получаващи Т-клетки, компетентни за PTPN2, но само леко при мишки, получаващи Т-клетки с дефицит на PTPN2 (Фигура 3b).

Наблюдаваните промени в развитието на Th клетки не се ограничават само до ламина на дебелото черво, тъй като открихме подобни промени в популациите IFN-γ + и IFN-γ +/IL17 + CD4 + и Treg в MLN и далака от PTPN2 fl/fl. xCD4Cre животни или Rag2 -/- мишки, получаващи Т-клетки с дефицит на PTPN2 (Фигура 3а, Допълнителна Фигура 7 a + b). Тези наблюдения показват индуцирането на провъзпалителен Т-клетъчен фенотип при стимулиране на възпалителната дисфункция на PTPN2 при индивид.

Загубата на PTPN2 в Т-клетките води до инфилтрация на Т-лимфоцити в органи извън червата и автоимунни реакции

Това показва, че загубата на PTPN2 в Т-клетките влияе върху състава на чревната микробиота към микробиотична дисбиоза, която е подобна на тази при човешкото хронично чревно възпаление, напр. CD. По време на възпаление, чревната дисбиоза изглежда се влошава при PTPN2 fl/fl xCD4Cre мишки и може да допринесе за общата повишена тежест на колит при тези животни. Тъй като обаче бяха анализирани ограничен брой от шест мишки на група, нашите проучвания ще подсилят по-нататъшни изследвания.

Наличието на CD-асоцииран вариант на PTPN2 води до повишена генна експресия, свързана с Th1 и Th17 при чревни биопсии на пациенти с IBD.

Промените, наблюдавани при мишки, съответстват на ситуацията при пациенти с CD хомозиготен за нефункционалния вариант на SNP rs1893217 C. При тези пациенти открихме повишени нива на Th1 и Th17-свързани гени, но намалени регулаторни и Th2-свързани генни транскрипти в биопсии от възпалени области. В пробите от пациенти обаче свързаните с Th17 промени в гените/цитокините са по-изразени, отколкото при мишки. PTPN2 играе важна роля в целостта на епителните клетки 33 и секрецията на цитокини от антиген представящи клетки (APC); 31, 34, следователно по-изразеният Th17 фенотип при пациентите може да отразява дисфункционален PTPN2 не само в Т-клетките, но и във всички видове клетки, присъстващи в червата. Установихме повишени нива на експресия на IL-13 и IL-10 при пациенти с WT CD. Тези цитокини са свързани с повишени нива на Th2 и Treg клетки; клетъчните подмножества не се считат за причини за възпаление в CD. Въпреки това, чревното възпаление, наблюдавано при CD, насърчава натрупването на Th клетки като цяло, което може да обясни наблюдаваното увеличение на тези два цитокина.

Повишеният потенциал на дефицитни на PTPN2 TTP клетки изглежда не е ограничен до червата, тъй като мишките, които нямат PTPN2 в Т-клетките, показват възпалителни инфилтрати в черния дроб и по-късно в бъбреците и кожата. Въпреки че участва в няколко възпалителни заболявания, не са съобщени корелации между вариантите на PTPN2 и кожни заболявания. Що се отнася до CD, тези спонтанни възпалителни инфилтрати са много интересни, тъй като проявите на екстраинтестинално заболяване са често усложнение при CD. 35 Все още обаче не е разгледана възможна връзка между вариантите на PTPN2 и чревни прояви. Нашите данни показват, че лезиите по кожата и бъбреците са резултат от генерализирана загуба на толерантност към загубата на Т-клетъчно специфичен PTPN2. Това посочва значението на PTPN2 в регулацията на Т-клетъчната хомеостаза поради няколко Т-клетъчно-медиирани автоимунни и възпалителни нарушения. Както вече показахме, че активирането на PTPN2 е достатъчно за подобряване на острия DSS-индуциран колит при мишки, 36 нашите открития могат да проправят пътя за напълно нова възможност за лечение на много хронични възпалителни и автоимунни заболявания, като CD, ревматоиден артрит, тип 1 диабет.целиакия, псориазис или системен лупус еритематозус.

Взети заедно, ние демонстрираме, че загубата на PTPN2 в Т-клетките води до промоцията на патогенни подмножества на Т-хелперни клетки, което води до повишена чувствителност към чревно възпаление. Освен това загубата на PTPN2 води до обща загуба на толерантност при по-стари, обикновено не автоимунно предразположени мишки B6/C57, което води до възпалителни инфилтрати в много органи. Нашите открития, получени при мишки, приличат на CD пациенти с CD-асоцииран генен вариант, а чревната дисбиоза в нашите модели на мишки тясно корелира с тази, наблюдавана при пациенти с CD. Тези наблюдения подкрепят решаваща роля за PTPN2 в патогенезата на хроничните възпалителни заболявания и по-специално CD и предполагат, че дисфункцията на PTPN2 може да бъде една от движещите сили за хронично възпаление и автоимунитет при човека.

методи

Индукция на мишки и колит

Мишките CD4Cre на фона на B6/C57 са закупени от Taconic (Кьолн, Германия), RAG2 -/- мишки от Janvier (Saint-Bellevin Cedex, Франция), PTPN2 fl/fl от EUCOMM. Мишки без PTPN2 в Т клетки се генерират чрез кръстосване на PTPN2 fl/fl мишки с CD4Cre животни. Всички мишки, използвани за експерименти, са били жени и са били държани в специфично съоръжение без патогени и експериментите са били извършвани с одобрението на местния орган за хуманно отношение към животните, а именно Ветеринарната служба на кантон Цюрих, Швейцария. За прехвърляне на колит, наивни Т клетки бяха изолирани, използвайки Miltenyi наивен комплект за изолиране на Т клетки II (Miltenyi, Gladbach, Германия) и 2,5 × 105 клетки, инжектирани ip в RAG2 -/- гостоприемници. Чистотата на наивните Т-клетки (дефинирани като CD4 +/CD62L висока/CD44 ниска/CD25 - клетки) е> 94%, както се анализира чрез поточна цитометрия. Остър DSS колит се предизвиква чрез прилагане на 2,5% DSS (MP Biomedicals, Carlsbad, CA) в питейната вода в продължение на 7 дни. Мишките бяха убити на ден 10. Хроничният DSS колит се индуцира чрез прилагане на четири цикъла, състоящи се от 7 дни 2% DSS, последвани от 10 дни нормална питейна вода. Мишките бяха убити 4 седмици след последния цикъл DSS. За всички експерименти бяха използвани контроли за отпадъци.

Оценка на тежестта на колита и хистологичен резултат

Животните бяха анестезирани ip с 90-120 mg kg -1 телесно тегло кетамин (Vetokinol, Берн, Швейцария) и 8 mg kg -1 телесно тегло Xylazine (Bayer, Lyssach, Швейцария). Животните са изследвани, както е описано по-горе. 44 Записът е извършен с Karl Storz Tele Pack Pal 20043020 (ендоскоп Karl Storz, Tuttlingen, Германия). Колоноскопията се оценява, като се използва точкова система за миши ендоскопски индекс на тежест на колита (MEICS), както е описано по-рано 44, като се използват следните пет параметъра: (i) прозрачност на дебелото черво, (ii) промени в съдовия модел, (iii) фибрин видим, ( iv) гранулираност на повърхността на лигавицата и (v) консистенция на изпражненията. Хистологично точкуване за възпалителна инфилтрация и увреждане на епителните клетки беше извършено на хематоксилин и оцветена с еозин част от най-дисталния 1 cm от дебелото черво на мишката. 44, 45

In vitro диференциация на Th-клетки

Наивни Т-клетки бяха изолирани, използвайки Miltenyi наивен Т-клетъчен комплект II. Чистотата е> 97%, както се анализира чрез поточна цитометрия. За Th диференциация, 0,5 × 10 6 клетки на ml се стимулират с 1 μg ml −1 свързан с плаката анти-CD3 и 1 μg ml −1 разтворим анти-CD28 при Th1-изкривяване (10 ng ml −1 IL-12, 10 ng ml -1 IFN-γ плюс 10 μg ml -1 анти-IL-4), Th2-изкривяване (10 ng ml -1 IL-4, 10 μg ml -1 анти-IFN-γ плюс 10 μg ml -1 анти -IL-12), Th17-изкривяване (1 ng ml -1 TGFβ1, 10 ng ml -1 IL-6, 10 μg ml -1 анти-IL-4, 10 μg ml -1 анти-IFN-γ плюс 10 μg ml -1 анти-IL-12), или Treg изкривяване (3 ng ml -1 TGFβ1, 20 ng ml -1 IL-2, 10 μg ml -1 анти-IL-4, 10 ng ml -1 анти-IFN -γ плюс 20 μg ml -1 анти-IL-12) условия в среда RPMI 1640 (Life Technology, Карлсбад, Калифорния), допълнена с 2% фетален телешки серум и пеницилин-стрептомицин (Sigma, Buchs, Швейцария).

Анализ на микробиота

Високопроизводителното секвениране беше извършено върху цекална ДНК, като се използва система 454 Life Sciences в комбинация с химия на титана (Roche AG, Базел, Швейцария). Секвенирането и анализите бяха извършени в Microsynth (Balgach, Швейцария). Насочена е хиперпроменливата 16S рРНК област V3 - V5. Ампликоните се определят количествено, като се използва Quant-iT PicoGreen dsDNA комплект за анализ (Life Technologies). Таксономична класификация за всяко четене беше извършена с помощта на Mothur въз основа на байесов метод, 46 използвайки kmer размер от 8 bp и 1 000 повторения. Като референтни бази данни бяха използвани референтната таксономия Greengenes (актуализирана през юни 2013 г.) 47 и референтната таксономия Silva 48. Стойностите на Bootstrap под границата от 70% бяха маркирани като некласифицирани.

Пациентски проби

Проби от чревна тъкан са взети чрез ендоскопия от макроскопски възпалени, както и от невъзпалени участъци на терминалния илеум, дебелото черво или ректума на пациенти с CD (див тип (TT): n = 15, възрастов диапазон: 27–66, средно: 47,4 ± 13,5 години; вариант (CC): n = 8, възрастов диапазон: 28–69, средно: 43,8 ± 18,3 години) и от пациенти, които не са IBD контролни (n = 8, възрастов диапазон: 37–61, средно: 49,1 ± 9,5). Контролните пациенти са били безсимптомни и са били представени за скрининг на рак на дебелото черво. Писмено информирано съгласие беше получено преди събирането на образци и проучванията да бъдат одобрени от местната комисия по етика. Пациентите бяха съпоставени по възраст, пол и активност на заболяването. Генотипът PTPN2 за свързания с CD SNP rs1893217 се определя, използвайки технологията TaqMan (Life Technologies), както е описано по-горе. 31

Статистически анализ

Освен ако не е посочено друго, данните са представителни за един от двата независими експеримента с по n повторения, данните са представени като средна и стандартна грешка на средната стойност. Статистическата значимост беше определена с помощта на теста на Wilcoxon-Mann Whitney.

Допълнителна информация

PDF файлове

Допълнителни изображения

Word документи

Допълнителни фигури Легенди и методи

Принос на автора

MRS извършва експерименти, анализира данните и пише първата чернова на ръкописа; SK, CG, TR, IF, SL и KA извършват експерименти и участват в анализа на данните; FM и BB са участвали в анализа на поточната цитометрия; CC и CL извършиха анализ на микробиота; SRV, MF, GR и MS са участвали в получаването на проби от пациенти; MS замисля, проектира и контролира проучването. Всички автори са написали, коригирали и одобрили ръкописа.