абстрактно
Основното
Изображение в пълен размер
Изследвахме разпределението на PKA изоензима (Фигура 1в). В Cc, мутантни Ct - m и RI и трансфектанти, нивата на PKA-I са се увеличили 1,5 пъти, без да се променят нивата на PKA-II. При RII и трансфектантите нивата на PKA-I намаляват с 40%, а нивата на PKA-II се удвояват. RII p и RII p-P трансфектантите значително намаляват нивата на PKA-I (до 25% от нивата на родителските клетки) и удвояват PKA-II. По този начин свръхекспресията на R1a или C7 не може да потисне експресията на PKA-II, докато свръхекспресията на RIIa, RIIp или RIIp-P значително намалява експресията на PKA-I, което показва благоприятно производство на PKA-II спрямо PKA-I (Otten and McKnight, 1989, Otten et al., 1991; Nesterova et al., 1996; Lee et al., 1999). Забележително откритие е, че мутантният RIa-P, за разлика от RIa от див тип, може да потисне PKA-II (Фигура 1в, RIa-P), както беше показано по-рано в други ракови клетки (Lee et al., 1999). до по-висок афинитет Са за мутант Ria-P, отколкото за Ria, RIIa или RIIp (Lee et al., 1999).
RII p и RI α-P клетки показват увеличение на апоптотичните ядра (Фигура 1d и e). В допълнение, тези клетки понижават регулирането на антиапоптотичния протеин Bcl-2; регулирани проапоптотични протеини Bax, Bak и Bad; и повишено лошо хипофосфорилиране (Фигура 1f), което показва, че насърчаването на апоптозата като лошо фосфорилиране води до антиапоптоза (Harada et al., 1999).
Ние изследвахме свойствата на растеж на генни трансфектанти на PKA субединица in vitro и in vivo. В еднослойната култура RIIp и R1a-P трансфектантите показват 80% инхибиране на растежа, а RIIa и RIIP-P трансфектантите показват слабо инхибиране на растежа (Фигура 1g). За разлика от това, R1a, Cc - m, Ca или трансфектанти само с вектор растат със същата или по-бърза скорост от клетките за родителски контрол. Освен това, в модел на гола мишка, растежът на тумора in vivo е значително намален само при трансфектантите RIIp и RI α-β (Фигура 1h).
Инхибирането на туморния растеж in vivo, наблюдавано при RIIp и RI α-β трансфектанти, корелира с промените в тяхната морфология на клетките в клетъчната култура in vitro. Нетрансфектираните родителски клетки показват морфология с кръгла форма, показваща главно голямо ядро с малка цитоплазма и нараства чрез натрупване (Фигура 1j). Значителни промени в морфологията на клетките настъпиха в RII β и RI α-β клетки. Тези клетки показват голям или продължителен плосък фенотип, който прилича на плоския ревертант, описан по-рано (Noda et al., 1985). И двете клетки показват увеличена цитоплазма и по-малко ядро, което води до повишено съотношение между цитоплазма и ядро и нараства леко (Фигура 1j). Всички други трансфектанти - Ca, Cc - m, RIIa, RIIa и RIIp - P - показват морфология, подобна на парентералните неинфекциозни агенти (Фигура 1j).
Изображение в пълен размер
Северен анализ на гени, променени в PC3M клетки, трансфектирани с PKA C и RII p гени. Общата клетъчна РНК се приготвя от парентерални и трансфектирани PC3M клетки, като се използва Rneasy Midi Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), електрофореза, найлонова мембранна блотинг и се подлага на Northern blot анализ (Nesterova et al., 1996). Данните представляват един от двата независими експеримента, които дават подобни резултати. Специфични cDNA фрагменти, съответстващи на съответните гени, са генерирани чрез PCR. TGFBR3, трансформиращ растежен фактор, бета рецептор III; AKT2, вирусен онкогенен хомолог на 2 v-act миши тимор; ММР-1, матрична металопротеиназа 1; RBBP2, белтък, свързващ ретинобластома 2; PAI2, инхибитор на плазминогенов активатор, тип II; AOE372, тиоредоксин пероксидаза
Изображение в пълен размер
По този начин, RII β-индуцираното обръщане на тумора може да включва дерегулация на клетъчния цикъл, водещо до спиране на клетъчния цикъл, както и индукция на апоптоза (Фигура 1d-f). Изненадващо, клъстер от гени, участващи в клетъчната диференциация, беше индуциран в RII-β-ре-експресиращи клетки и тези гени бяха непроменени в C18-репресионни клетки (Фигури 2в и 3). Неотдавнашно проучване на геномния анализ на CREB-насочени гени разкри необходимост от ядрен промотор за чувствителност към cAMP (Conkright et al., 2003). Възможно е диференциращите гени, индуцирани в RII β клетки, да бъдат мишени за RII β-медиирана генна индукция (Srivastava et al., 1998), директно или индиректно чрез CRE/CREB. По-нататъшното характеризиране на тези диференциращи гени хвърля светлина върху механизма на PKA сигнализиране при апоптоза/диференциация на туморни клетки.
Тези резултати показват, че R1α- и С-репресивни клетки, съдържащи надрегулиран PKA-I, показват промени в профила на генна експресия, които са противоположни на тези на RII клетки p-re-експресиращи клетки, съдържащи предимно PKA-II. По този начин, cDNA микрочиповете разкриват положителна и отрицателна cAMP сигнализация за растежа на туморни клетки, индуцирана от диференциална експресия на регулаторните субединици на PKA.
След това използвахме конфокална микроскопия, за да изследваме вътреклетъчната локализация на Cp и RIIp (Фигура 4а). Родителски клетки и клетки с Cα-, R1a и R1- и -P-свръхекспресиращи клетки показаха всички оцветяване с Cα (зелено) и RIIB оцветяване (червено), което беше изключително цитоплазматично; C и RII p бяха колокализирани, както е показано на изображението с наслагване (жълто). В тези трансфектанти малко клетки показват едно ясно място в оцветяване С и RII р, което е жълто в слоя и се потвърждава чрез разглеждане на разрези в ядрото. В допълнение, R1- и -експресионните клетки експресират оцветяване на Ca и RIIβ, концентрирани в перинуклеарната област, докато клетките, свръхекспресиращи R1a-β, показват увеличение на RIIβ оцветяването в цялата цитоплазма и в видимия център, организиращ микротубулите.
Изображение в пълен размер
RII p-репресивните клетки изглеждаха увеличени. Присъстваха по-малко клетки, което е една от тях. Най-важното е, че в този припокриващ се изглед α и RII p изглеждат напълно колокализирани. Тази субклетъчна колокализация на RIIp и C7 не се ограничава до апоптотични RIIp клетки. Когато RII β клетки, при липса на лечение с Zn 2+, експресират само ограничено количество RII β (LTR-задвижвана транскрипция (Nesterova et al., 1996)), където клетките са проапоптотични, Ca и RII β колокализация са също се наблюдава (Фиг. 4b), което показва, че Ct-RIIp колокализацията предотвратява клетъчната апоптоза. По този начин, RIIβ свръхекспресионните последователности Cc в холоензима с RIIp, блокират C активирането и водят до променена cAMP сигнализация в тези клетки. Удивително е, че в ядрото е инвагинирано силно оцветяване на Cα и RII ß, което се потвърждава от разрез на разрез, който е бил в ядрото, а не близо до него, или поради инвагинация на ядрената мембрана. Тази физическа блокада на C a, причинена от RII ß в клетъчното ядро, може да обясни поне частично конфликтния експресионен профил на C и RII β трансфектантите, разкрити от ДНК микрочипове. Клетките, които свръхекспресират RIIp-P или RIIa, показват оцветяване на Ca и RIIP, имитиращи родителски клетки, но не и клетки, експресиращи RIIp-ere-.
дискусия
В нашето проучване ние свръхекспресирахме диви и мутантни форми на PKA регулаторни и каталитични субединици в PC3M ракови клетки на простатата и сравнихме ефекта върху образуването на изозим, клетъчната морфология, клетъчната пролиферация, генната експресия и туморния фенотип. Функционалната характеристика на сАМР-свързващата мутация при PKA тип I е проучена задълбочено (McKnight et al., 1988), докато функционалният анализ на RI и субединиците на мястото на псевдофосфорилиране (Taylor et al., 1988) почти не е проучен (Durgerian and Taylor)., 1989, Lee et al., 1999). Използвахме RI и мутант, R1a - P, който придобива място за автофосфорилиране (ala → ser) чрез точкова мутация G → T (Durgerian and Taylor, 1989; Lee et al., 1999), за да имитира функционално RII. Също така използвахме RII β мутанта, RII β-P, на който липсва място за автофосфорилиране (ser → ala) чрез мутация на T → G точка (Budillon et al., 1995). За С и мутант използвахме N-терминален липсващ миристат мутант, Cc-m, за който беше показано, че е толкова активен, колкото див тип С и активира PKA в клетката (Clegg et al., 1989), докато в за разлика от дивия тип Cpa няма способността да секретира в извънклетъчното пространство (Cho et al., 2000).
Нашите резултати показаха, че RIIa-, RIIp- и RIIp-P клетките свръхекспресират PKA-II и почти напълно премахват PKA-I, докато R1a-, C7- и C7-m-свръхекспресиращите клетки увеличават PKA-I, но не мога да потисна PKA- II. Най-забележителното е, че клетките, свръхекспресиращи RIa-P, функционални миметици на RII, повишават PKA-I и значително понижават PKA-II. Показано е, че PKA-II е по-предпочитана форма на холоензима PKA пред PKA-I (McKnight et al., 1988). Едноточкова мутация на R1a на мястото на взаимодействие R и C, т.е. мястото на псевдофосфорилиране (Taylor et al., 1988), дава PKA-I (RIa-P, съдържащ PKA-I), имитиращ функционално PKA-II и като резултат, свръхекспресията му потиска ендогенния PKA-II.
Нашите резултати от класически биохимичен анализ, ДНК микрочипове и конфокална микроскопия потвърждават, че каталитичната С-субединица на PKA, свързана с регулаторната субединица RIa и образуваща холоензима PKA-I, е склонна към активиране в клетката, причинявайки активиране на голямо разнообразие на гени, стимулиращи растежа на туморни клетки; обратно, когато С субединицата е поставена в клетка в холоензимния комплекс PKA-II чрез свързване с регулаторната субединица RIIp, активирането на С-субединицата е ограничено, което води до потискане на туморния растеж и индукция на обратен фенотип.
Един от най-очарователните аспекти на PKA холоензимната система е способността на клетката да поддържа два вида киназа в клетката - PKA-I и PKA-II - и да предпазва C-субединицата от появата на R-субединицата. В началото на канцерогенезата PKA-I се увеличава с увеличаване на нивата на аденилат циклаза и сАМР в клетката (вж. Boynton and Whitfield, 1983). Ясно е, че нарушението на съотношението PKA-I-към-PKA-II в клетката е ненормален/опасен сигнал, който може да причини заболявания като рак. По този начин, нашето настоящо проучване предполага, че превключването на протеин киназа А изозим, чрез индуциране на диференциална cAMP сигнализация в клетката, може да осигури генна терапия, базирана на PC3M на простата PC-М и други видове рак.
Благодаря
Благодаря на Черил Пелерин от Palladian Partners, Inc., която предостави редакторска подкрепа на Националния институт по рака по договор N02-BC-76512/C2700212.