прекъсване

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Сензорните сигнали посредничат за улесняване или потискане на храненето
  • Вериги, които са в основата на улеснението на захранването
  • Вериги, които са в основата на потискането на мощността
  • Взаимно инхибиране между NSM и RIM/RIC неврони
  • Функцията "победителят поема всички" на централната интеграционна схема
  • дискусия
  • методи
  • племе
  • Молекулярна биология
  • Поведенчески тестове
  • Флуоресцентно изобразяване
  • Анализ на данни
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Поведение на животните
  • Поведение при хранене
  • Сензорни системи

абстрактно

Хранителното поведение се модулира от околната среда и вътрешните физиологични условия. Апетитът обикновено се подкрепя от приятната миризма (или външния вид) на храната и се унищожава от лошия вкус. Всъщност животните възприемат множество стимули на околната среда едновременно и не е ясно как тези сензорни входове са интегрирани и следователно се взема решение за съответно регулиране на хранителните навици. Тук показваме, че хранителните навици на Caenorhabditis elegans могат да бъдат подкрепени или с привлекателна миризма, или потиснати от репеленти. Чрез идентифициране на мутанти, които са дефектни в сензорно-медиираната регулация на храненето, ние анализирахме централна верига на тригера, която интегрира два противоположни сензорни входа и генерира бистабилен хормон, за да регулира хранителното поведение. Тъй като регулирането на храненето е основата за оцеляването на животните, предполагаме, че основната организационна логика, идентифицирана тук в C. elegans, вероятно ще се сближи при различни филити.

Животните трябва да се изправят пред сложни промени в обстоятелствата си. Тези фактори на околната среда включват "добри" и "лоши" физически и химични стимули, като приятни и отблъскващи миризми и високи и ниски температури. Не е ясно обаче как тези противоположни фактори модулират поведението.

Caenorhabditis elegans е оборудван с няколко сензорни модалности, които могат да открият околната среда, включително мирис, вкус, осмоларност, температура и механичен контакт. Той може да усети стотици водоразтворими и летливи молекули, които могат да причинят различно поведение, като привличане, избягване, хранене или чифтосване 1. Две двойки амфидни сензорни неврони, AWA и AWC, медиират хемотаксиса до атрактивни летливи аромати 2, докато друга двойка хемосензорни неврони, ASH, медиират избягването на висока осмоларност, висока концентрация на летливи миризми, горещи алкалоиди (например хинин) и детергенти. 3, 4, 5. Не е ясно колко привлекателни и отблъскващи сензорни сигнали са интегрирани за регулиране на поведението на животните.

C. elegans се храни чрез енергично изпомпване на фарингеалната тръба, което води до поглъщане на бактерии, концентрация, смилане и изтласкване на смачканата суспензия в чревния лумен 6. Когато избираме скоростта на изпомпване като изваждане и изискваме C. elegans с атрактанти и репеленти, откриваме, че атрактантите и репелентите улесняват и потискат храненето в C. elegans. Освен това, като идентифицираме и характеризираме мутанти, които са дефектни при сензорно-медиирано улесняване и потискане на храненето, ние демонстрираме молекулярната и невронна верига на C. elegans, която интегрира противоположни сензорни входове в регулирането на скоростта на изпомпване. Вместо линейна сума от сензорни стимули, ние разкриваме нелинейна интеграция в централните невросекреторни клетки. Заключваме, че функцията "победителят поема всички" на централната интеграционна верига осигурява стабилно поведение при хранене в присъствието на шумни стимули от околната среда.

резултатът

Сензорните сигнали посредничат за улесняване или потискане на храненето

Първо тествахме дали организмите, толкова прости, колкото червеите, могат да променят хранителното си поведение в отговор на стимулите от околната среда, подобни на човешките същества. Атакувахме червеите с атрактивни аромати, диацетил и ниска концентрация на изоамилол 2, или репеленти като хинин и висока концентрация на изоамилол 7, 8. Установихме, че концентрациите на диацетил 10% или повече увеличават скоростта на изпомпване с

25%, явление, което наричаме хранене по-лесно (фиг. La). Улесняване на храненето се наблюдава и при ниски концентрации на изоамилол (разреждания 10-4 до 10-5, допълнителна фигура S1), атрактант, който се открива главно от AWC 2 неврони. Освен това наблюдавахме потискане на храненето, при което скоростта на изпомпване беше намалена до много ниско ниво, в зависимост от дозата при високи концентрации на изоамилол или хинин (фиг. 1а, б). Въз основа на кривите доза-отговор, ние избрахме концентрации от 100, 100% и 5-10 тМ за диацетил, изоамилол и хинин за следващите експерименти, освен ако не е отбелязано друго. Измерихме скоростта на изпомпване между 5 и 10 минути, когато стимулите имаха максимален ефект (фиг. 1в). Възможните ефекти на тези химикали върху движението бяха изключени чрез наблюдение на извивките на тялото по време на краткосрочно или дългосрочно излагане на химикали (Допълнителна фигура S2).

Вериги, които са в основата на улеснението на захранването

След това изследвахме сигналните пътища по различни сензорни модалности. Невротрансмитерът 5-хидрокситриптамин (5-НТ, серотонин) регулира поведението и физиологията, свързана с храната, при различни видове гръбначни и безгръбначни 15, 16, 17, 18. Известно е, че 5-HT увеличава скоростта на изпомпване при липса на храна 19, докато мутантите tph-1, които не успяват да синтезират 5-HT, показват намалено хранене 17. При наличие на храна се съобщава, че екзогенният 5-HT (13 mM) не стимулира изпомпването 20. За разлика от това наблюдавахме

25% увеличение на скоростта на изпомпване при екзогенно приложение на 2 mM 5-HT (фиг. 2а), в съответствие с наблюденията, направени в изследването на Srinivasana et al., 21, в което са използвани 5 mM 5-HT. Интересното е, че потвърдихме, че само ниските концентрации на 5-HT (2-5 mM) могат да улеснят храненето в присъствието на храна (допълнителна фигура S8), което предполага, че високите концентрации на 5-HT могат да предизвикат адаптация или автоинхибиране на хранителната регулация. предложено от Hobson et al. Диацетил-медиираното, но не 5-НТ-медиирано подобряване на изпомпването е премахнато при tph-1 мутанти (Фиг. 2а, б), което предполага участието на 5-НТ в сензорно-медиирано хранително улесняване. В хермафродит C. elegans, експресията на tph-1 е ограничена само до няколко серотонергични неврони, като NSM, ADF и HSN 17, 22. За да локализираме мястото на освобождаване на 5-HT, използвахме специфични за невроните промотори, за да стимулираме експресията на TPH-1 в мутанти на tph-1. Разтваряне на tph-1 в подгрупа от клетки, които се припокриват със серотонергични неврони в NSM спасено улесняване на храненето (Фигура 2в), което предполага, че TPH-1 действа в невроните на NSM.

Маса в пълен размер

Вериги, които са в основата на потискането на мощността

Инхибирането на изпомпването, индуцирано от хинин и изоамилол, беше напълно блокирано при tdc-1 мутанти, докато изпомпването на tbh-1 мутанти беше инхибирано само частично (фиг. 3а и допълнителна фиг. S10a). tbh-1 кодира TA β-хидроксилаза, необходима за превръщането на TA в OA30. Тези резултати са в съответствие с инхибиращата роля на TA/OA в регулирането на изпомпването 32 .

Взаимно инхибиране между NSM и RIM/RIC неврони

а - д ) Примери за времеви курсове и статистически данни за нивото на калций в NSM ( а, б ) и RIM ( ° С, д ) на неврони на свободно движещи се животни върху храна в отсъствие (контрол) или в присъствието на 100% диацетил (червено). и 5 тМ хинин (син). Сивите кутии показват продължителността на химическото приложение. ( д ) Способността на диацетил да инхибира нивата на калций в RIM невроните е загубена при мутанти tph-1 и mod-1, но е спасена чрез трансгенна експресия на tph-1 в NSM и mod-1 в RIM/RIC неврони. ( е ) Индуцираното от хинин инхибиране на нивата на калций в невроните на NSM беше отменено при tdc-1 и ser-2 мутанти, но беше спасено чрез трансгенна експресия на tdc-1 в RIM/RIC и ser-2 в NSM неврони. Ptdc-1 за RIM/RIC, Ptph-1 за NSM бяха използвани като промотори. Статистика ( б, д - е ): * P

методи

племе

Щамовете на C. elegans се култивират в плаки със среда за растеж на нематоди (NGM) при 20 ° C, като се използват бактерии от E. coli OP50 като източници на храна, съгласно стандартните методи 39 .

Щамовете са получени от CGC (//www.cbs.umn.edu/CGC/) и Националния проект за биоресурси (//www.shigen.nig.ac.jp/c.elegans/index.jsp). Щамовете, използвани или генерирани в това проучване, са изброени в допълнителна таблица S1. Животните с двойни и тройни мутации с желаната комбинация от мутации бяха потвърдени чрез PCR и секвениране. Всички трансгенни щамове са генерирани по публикувани методи 40. Плазмидите се инжектират при 50 ng μl -1 заедно с unc-122: rfp (20 ng μl -1) като маркер за съвместно инжектиране, освен ако не е посочено друго. За всеки спасителен експеримент бяха тествани поне три независими линии.

Молекулярна биология

За производството на конструкции е използвана технология Gateway. GFP кодиращата последователност на pPD95.75 вектора (подарък от A. Fire) е заменена с гените tdc -1 G-CaMP 2.0, TagRFP-T или C. elegans, за да се създаде серия от модифицирани вектори. Касетата attP1-ccdB-CmR-attP2 се усилва чрез PCR от pDONR221 (Invitrogen) с олиго, съдържащо или Hin dIII, или места за ограничаване на възраст I. След това PCR фрагментът се пречиства и субклонира в уникалните Hin dIII и Age I места в pPD95. .75 и други модифицирани вектори, изброени по-горе, за да се получат модифицирани вектори за вход на порта.

Промоторите на tph-1, tdc-1, gcy-13, tbh-1 и mod-1 се усилват чрез PCR от N2 геномна ДНК, като се използват праймери, съдържащи остатъци attB1 и attB2. Тези PCR фрагменти бяха рекомбинирани с attP1 и attP2 места в модифицирани донорни вектори чрез рекомбинантна BP реакция. По този начин P tph-1: G-CaMP2.0, P tdc-1: G-CaMP2.0, P tph-1: GFP, P tdc-1: GFP, P mod - 1: Създаден от плазмиди TagRFP-T, Pgcy-13: tdc-1 и Ptbh-1: tdc-1. Дължините на промоторите tph-1, tdc-1, gcy-13, mod-1 и tbh-1 са 4, 5, 4, 4, 2, 3, 5, 5 и 4, 6 kb.

За да се конструира плазмид P tph-1: ser-2, cDNA последователността на гена C. elegans ser-2 беше субклонирана в SalI и KpnI местата на вектора pPD49.26 (подарък от A. Fire). След това промоторът на tph-1 беше вмъкнат между SphI и SalI местата на вектора.

За да се конструира плазмид P tdc-1: mod-1, 4 073 bp геномна ДНК фрагмент, съдържащ всички mod-1 интрони и екзони, беше PCR амплифициран от N2 геномна ДНК и субклониран в NheI и KpnI сайтовете на pPD49.26 вектора. След това tdc-1 промоторът беше вмъкнат между BamHI и NheI местата във вектора.

За да се конструира Ptph -1: glr -7 плазмид, 3,657 bp геномна ДНК фрагмент, съдържащ всички glr-7 интрони и екзони, се амплифицира чрез PCR от генома на N2 DNA и се субклонира в Nhe I и KpnI сайтовете на pPD49.26. Промоторът на tph-1 се вмъква в MscI и NheI местата на вектора.

Поведенчески тестове

Всички поведенчески тестове са извършени върху млади възрастни. За да тестваме скоростта на изпомпване, измерихме времето, необходимо за завършване на 20 помпи. За всяко животно бяха записани четири до шест измервания и бяха изследвани най-малко 8 до 12 животни на експеримент, като всички експерименти бяха повторени поне три пъти. За да се тества ефектът от различни летливи химикали върху модулацията на фуражите, добре хранените червеи за млади възрастни бяха прехвърлени в нови плочи, засяти с OP50. След 10 минути към капака се добавят 2 ul летливи химикали (диацетил или изоамилол, всички от Sigma) и плочата се запечатва за 5 минути, преди да се отчете скоростта на изпомпване. Серотонинът, ТА и ОА се разтварят в M9 буфер и се разпространяват върху хранителни NGM плаки с крайна концентрация 2 тМ. Хининът се разтваря в М9 буфер при концентрация 5 тМ и се нанася върху NGM плаки. Младите възрастни бяха прехвърлени в тези NGM плаки след 2 часа и броят на помпите беше преброен след 5 минути в продължение на 10 минути. М9 буфер се добавя към плаката за контрол.

Изключването на 100% изоамилол беше измерено, както е описано по-рано 5 с малки модификации: добре хранените животни бяха прехвърлени в чинии за храна за 10 минути. След това покритият 1 MQ стъклен електрод се потапя в 100% изоамилол и се поставя пред носа на животното на предното животно за 2 s. Отговорът на отделните животни в рамките на 4 s се записва като положителен (движение назад) или отрицателен (без движение назад) отговор.

Тестът за движение, използван тук, се основава на теста, използван в предишното проучване 41. Накратко, контролните животни и животните, изложени на химикали, бяха прехвърлени в чинии без храна. След 10 минути броят на флексиите на предното тяло се отчита на интервали от 20 s в продължение на 5 минути.

Флуоресцентно изобразяване

Флуоресцентни изображения на G-CaMP2.0 са направени под флуоресцентен микроскоп Zeiss Discovery V8 с обектив x20. Младите възрастни червеи, експресиращи G-CaMP2.0 в неврони NSM или RIM/RIC, бяха прехвърлени в нови ястия с NGM, инокулирани с OP50. В капака беше изрязана дупка и покрита с 25 mm 00 # покривно стъкло, към което бяха добавени 2 ul летливи химикали. Хининът се добавя директно към плочата с агар. След това плочите бяха запечатани и след 5 минути химическа стимулация бяха направени изображения на клетъчните тела, когато скоростта на изпомпване вече се беше увеличила (диацетил) или намалила (изоамилол или хинин). За измерване на хода на Ca 2+ беше използван инвертиран флуоресцентен микроскоп на Olympus IX81, оборудван с обектив × 20, NA0.75. За да задържим движещия се неврон на червея в зрителното поле на зареденото устройство, използвахме системата PhotoTrack от Applied Scientific Instrumentation (ASI, Eugene, USA), комбинирана с XI етапи на ASY със затворен цикъл 42. Флуоресценцията на G-CaMP2.0 NSM или RIM/RIC неврони в свободно движещи се червеи е записана от системата PhotoTrack с помощта на Andor Luca EM-CCD при 2 Hz.

Колокализацията на tdc-1: GFP и mod-1: TagRFP-T или tph-1: TagRFP-T и ser-2: GFP беше изследвана с помощта на лазерна система за конфокална микроскопия Andor Revolution XD, базирана на въртене - дискова конфокална сканираща глава, CSU-X1 (Yokogawa Electric), под контрола на софтуера Andor IQ 1.91. Конфокален микроскоп е конструиран върху обърнат микроскоп Olympus IX-71 (Olympus, Токио, Япония), оборудван с обектив x60 (числена апертура = 1,45, Olympus, Япония). Изображенията бяха показани и анализирани с помощта на Image-J 1, 43b (Wayne Rasband, Национален здравен институт, САЩ).

Анализ на данни

Анализът на данните беше извършен с помощта на IGOR Pro 5.01 (Wavemetrics, Portland, OR, USA). Резултатите се отчитат като средни стойности ± 10 до 12 животни, освен ако не е посочено друго. Статистическата значимост е оценена с помощта на t-тест на Student. Звездичките показват статистическа значимост: * P