цитомегаловирус

  • елементи
  • абстрактно
  • целта:
  • Уча дизайн:
  • резултатът:
  • заключение:
  • Въведение
  • методи
  • Изследване на населението
  • приготвяне на пробата
  • Събиране на клинични данни
  • серология
  • Количествен PCR анализ в реално време
  • Усилване UL144 гени и ДНК секвениране
  • Статистически анализи
  • резултатът
  • дискусия

елементи

  • педиатрия
  • Вирусна инфекция
  • Вирусно предаване

абстрактно

Проспективно оценихме скоростта на предаване на постнатален цитомегаловирус (CMV) през майчиното мляко при изключително недоносени бебета, за да обърнем внимание на ефекта от CMV инфекцията върху недоносени бебета по време на кърмене.

Уча дизайн:

В проучването са включени общо 25 майки и 27 деца (два комплекта близнаци) с тегло при раждане 1. Вродената CMV инфекция е свързана със значителни дългосрочни последици като сензоневрална загуба на слуха и умствена изостаналост. 2, 3 За разлика от вродените инфекции, по-малко се набляга на ефектите от получаването на постнатална CMV, вероятно защото често е асимптоматична и се смята, че води до ниска заболеваемост. 4 Въпреки това, скорошни проучвания, които показват, че постнаталните CMV инфекции при недоносени бебета причиняват сериозни клинични признаци, включително респираторни компромиси, неутропения, тромбоцитопения, хепатомегалия и септични синдроми, отново предизвикват интерес към ефектите на този патоген в непосредствения постнатален период. 5, 6, 7

методи

Изследване на населението

Това проспективно проучване включва недоносени кърмачета и техните майки, приети в Университетската болница в Нагоя, Първата болница на Червения кръст в Нагоя и Общинската болница в Огаки от 1 април 2003 г. до 30 септември 2004 г. Проучването включва недоносени бебета с гестационна възраст 2500 g. Комитетът по етика на всяка институция одобри проучването и всички родители или настойници получиха писмено информирано съгласие преди записването.

приготвяне на пробата

Взети са кръвни проби от всяка майка за изследване на CMV антитела през първата седмица след раждането; коластрата беше отстранена; и се вземат проби от кърма на всеки 2 седмици, докато бебетата бъдат освободени. Взети са проби от кръв и урина от всяко бебе в продължение на 1 седмица след раждането, за да се направи скрининг за вродени CMV инфекции; След това се вземат проби от кръв и урина на всеки 2 седмици до изписването; по време на изписването беше взета друга кръвна проба за изследване на CMV антитела. Когато донорското мляко е дарено на деца, проби от донорско мляко се вземат на всеки 2 седмици за скрининг. В случаите, когато бебетата получават кръвопреливане, част от кръвния продукт се събира за тестване. Всички трансфузирани кръвни продукти бяха пълни с левко с филтри. Коластрата, кърмата, донорското мляко, кръвните продукти за трансфузия, пробите от серум и урина се съхраняват при -20 ° C преди употреба.

Събиране на клинични данни

Клиничните находки като непоносимост към храна, коремно раздуване, хепатомегалия, петехии, апнея и хипотония бяха оценени и записани от подходящия лекуващ лекар. Всяка седмица се вземаха кръвни проби от бебета, за да се проверят лабораторни аномалии като неутропения, тромбоцитопения, повишени чернодробни ензими и хипербилирубинемия. Лекуващите лекари бяха заслепени за резултатите от PCR тестове в кърмата и за серологичния статус на майката CMV.

серология

Анти-CMV имуноглобулинови (Ig) G и IgM антитела бяха идентифицирани с помощта на набор от ензимни имуноанализи (Denka Seiken, Токио, Япония).

Количествен PCR анализ в реално време

ДНК се извлича от 200 μl серум за кърмачета, кръвен продукт и нефракционирано кърма с помощта на QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Германия) и се елуира в 100 μl дестилирана вода. ДНК беше извлечена от 140 μl проби от урина за кърмачета с помощта на комплекта за вирусна РНК QIAamp (Qiagen) и елуирана в 100 μl дестилирана вода.

PCR в реално време се извършва за всяка извлечена ДНК проба, за да се определи количествено броят на копията на CMV ДНК. PCR праймерите и сондите, използвани в този анализ, са проектирани да насочват непосредствения ранен CMV ген. 13 PCR в реално време са извършени с помощта на TaqMan PCR Kit и Model 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), както е описано по-горе. 9, 14, 15 Границата на откриване на този анализ беше 100 копия ml-1 .

Амплификация на ген UL144 и секвениране на ДНК

Когато CMV ДНК е открита в проби от урина или серум, се извършва секвениране на гени UL144. Генът UL144 се усилва чрез вложена PCR. Използвани са следните PCR праймери: външен праймер (5'-TCGTATTACAAACCGCGGAGAGGGAT-3 '), външен обратен праймер (5'-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3'), вътрешен преден праймер (5'-CTTCCGGTAGGCATGAA-3 ') и вътрешен реверс -GACTCATGTGT -3 '). PCR продуктите бяха директно секвенирани с помощта на BigDye Terminator Cycle Sequence Kit и ABI PRISM 3100 Automated Sequencer (Applied Biosystems).

Статистически анализи

Различията в категориалните променливи бяха анализирани с помощта на χ2 тест; Различията в средните стойности бяха анализирани чрез U-теста на Mann-Whitney. Статистическите анализи бяха извършени по предназначение чрез лечение със Statview 5.0 (SAS Institute, Berkeley, CA, USA).

резултатът

По време на периода на проучване 25 майки и 27 от техните деца (два комплекта близнаци) отговарят на критериите за влизане. Средната гестационна възраст е 26,4 седмици (диапазон 23, 7 до 32, 6 седмици), а средното тегло при раждане е 802 g (диапазон 512 до 1108 g). Средната продължителност на наблюдението е 99 дни (от 70 до 154 дни). Имаше общо 14 деца, момчета и 13 момичета. Седем деца са родени вагинално, а 20 са родени чрез цезарово сечение.

Фигура 1 показва серопреобладаването на CMV майки в нашата кохорта и честотата на предаване на CMV. Общо 21 от 25 майки (84%) са серопозитивни за CMV. ДНК на CMV е открита в кърмата при всички серопозитивни майки. CMV ДНК не е открита в майчиното мляко на серонегативни майки по време на периода на изследване. Фигура 2 показва броя на копията на CMV ДНК в кърмата, анализирана чрез PCR в реално време. Общо 7 от 20-те проби от коластра (35%) съдържат CMV ДНК. На 2 седмици след раждането броят на копията на CMV ДНК се увеличава и достига максимум от 4 до 6 седмици след раждането. Освобождаването на CMV ДНК в кърмата продължава до 8 седмици след раждането. 10 седмици след раждането, CMV ДНК е открита само в една проба; Не е открита CMV ДНК в кърмата 12 седмици след раждането.

Серопревалентност на майката и предаване на цитомегаловирус (CMV). Показани са серопревалентността на майката, скоростта на лактация на ДНК на CMV и скоростта на предаване на CMV. Предаването на CMV се е случило само при един пациент.

Изображение в пълен размер

Кинетика на цитомегаловирусен (CMV) номер на копие на ДНК в кърмата. Дадени са средните номера на копия на CMV ДНК във всички проби от коластра, както и майчиното мляко на 21 CMV серопозитивни майки. Номер на CMV ДНК копие беше измерен чрез PCR в реално време. Номерата на копията на ДНК на коластра се дават на възраст 0 седмици. Средните номера на CMV ДНК копия са обозначени с черни точки; лентите за грешки показват 95% доверителни интервали. Пунктираната линия показва границата на откриване на теста.

Изображение в пълен размер

Във всички 15 от 27-те деца те са били хранени с донорско мляко поне веднъж. Донорско мляко се доставя на един пациент от един донор. PCR е извършена върху общо 23 проби от донорско мляко и CMV ДНК е открита в 13 от 23 (57%) проби. В резултат на това 10 от 15 бебета (67%) са получили CMV ДНК-положително донорско мляко. Едно дете, чиято майка е серонегативно, е хранено с донорско мляко, но не е открита CMV ДНК в донорското мляко, което детето е получило.

Общо 20 от 27 деца се нуждаят от трансфузия на червени кръвни клетки. Средният брой трансфузии на червени кръвни клетки е 2 (диапазон от 1 до 8 пъти). Едно на 27 деца се нуждае от кръвопреливане на тромбоцити. ДНК на CMV не е открита в нито една от кръвните проби, използвани за трансфузия.

В изследваната популация анти-CMV IgM е отрицателен при изписване при всички деца с изключение на едно. От 21 бебета, чиито майки са имали положителни резултати за анти-CMV IgG, 4 деца са били положителни за CMV IgG след изписване, но 17 са били отрицателни. При 4 положителни бебета са взети кръвни проби за изследване на CMV антитела средно 77 дни (диапазон от 70 до 84 дни) след раждането, значително по-рано, отколкото при 17 отрицателни бебета със средно 98 дни кръвни проби. (диапазон от 70 до 154 дни) (P = 0,02). Тези данни предполагат, че четири положителни деца са запазили пасивно предадени анти-CMV IgG от майките си. И петте деца, чиито майки са били отрицателни за анти-CMV IgG, са имали отрицателни анти-CMV IgG при изписване.

дискусия

Diosi и сътр. 17 първи изолиран CMV от кърмата през 1967 г. Последващи проучвания показват, че степента на вирулактация във фракционираното мляко варира от 9 до 32%. 18, 19, 20 Наскоро реактивирането на майчините CMV по време на лактация се анализира чрез PCR. 9, 10, 11, 12, 21, 22, 23 В тези проучвания скоростта на CMV ДНК-лактация варира от 87,5 до 97,3%. В нашето проучване всички серопозитивни майки имат CMV ДНК в майчиното си мляко. Тези открития подкрепят схващането, че реактивацията на CMV се случва по време на лактация при повечето серопозитивни майки. Количествено определихме броя на копията на CMV ДНК в кърмата чрез PCR в реално време и описахме надлъжната кинетика на реактивирането на CMV. В нашето предишно проучване, при което популацията е значително по-възрастна от това проучване (средна гестационна възраст, 31 срещу 26 седмици; P 9 2 седмици след раждането, CMV ДНК е открита при повишени нива в кърмата и достига максимум 4 до 6 седмици след раждането в това проучване, кинетиката на CMV реактивация е почти същата, което предполага, че CMV реактивацията на майката е независима от гестационната възраст при раждането и че CMV реактивацията по време на лактацията започва 1 до 2 седмици след раждането и завършва 10 седмици след раждането.

Открихме CMV ДНК при едно дете, което получи CMV-положително мляко. За да потвърдим пътя на предаване, извършихме молекулярно епидемиологично проучване. Най-често срещаният ген на варианта щам при човешки CMV е гликопротеин В. 24 Миналата година обаче беше обърнато значително внимание на гена CMV UL144. UL144 кодира хомолог на медиатора за навлизане на херпесен вирус, член на суперсемейството на рецептора на тумор некрозис фактор 1 и може да бъде генетичен маркер за патогенезата на човешкия CMV. 25 Lurain et al. 26 съобщават, че UL144 има значителна променливост на специфична за щама последователност и затова ние го фокусирахме върху идентификацията на щама. Всички последователности, идентифицирани в майчиното мляко, съвпадат точно с последователностите в пробите на урината на бебето. Постнаталната CMV може да бъде получена чрез секреция на шийката на матката в родовия канал, кръвопреливане на кръв и кърма. Едното ни заразено дете е родено чрез цезарово сечение, но му е направено кръвопреливане два пъти. Всички кръвни продукти бяха левкоизпълнени, като по този начин до голяма степен се елиминира CMV; всъщност ДНК на CMV не е открита в нито една от кръвните проби. Извършвайки молекулярна характеристика на двойката майка-дете, ние потвърдихме, че предаването на CMV е станало чрез кърмата.

Пастьоризацията може да дезактивира CMV в кърмата. 20, 32 Hamprecht et al. 34 съобщава за намаляване на заразността с CMV на кърмата по три метода: замразяване и размразяване, пастьоризация на държача и краткотрайно нагряване в продължение на 5 s при 72 ° C. Заразността на CMV е елиминирана само в 1 от 10 проби чрез замразяване на млякото, но напълно елиминиран чрез пастьоризация на Holder и краткотрайно нагряване. Процесите на нагряване обаче имат няколко проблема: нагряването може да има негативен ефект върху качеството на кърмата, процесите изискват специално оборудване, кърмата отнема много време за приготвяне чрез пастьоризация от държача и възможността за опасни вещества, които се отделят от пластмасовите бутилки. не може да се изключи отоплението. Kurath и сътр. 7 не препоръчват общ подход нито чрез избягване, нито чрез пастьоризиране на майчиното мляко, което се основава на нисък процент на симптоматично заболяване, дори при високорискови недоносени бебета. Вместо това, за да се предотврати сериозна инфекция, те предложиха алгоритъм за кърмачета с недоносени деца в случай на CMV IgG положителна майка въз основа на здравословното състояние на недоносеното бебе. 36

В заключение, в зависимост от появата на кинетиката на CMV ДНК в кърмата, реактивирането на CMV започва 1 до 2 седмици след раждането и завършва 10 седмици след раждането. Дори при изключително недоносени бебета скоростта на предаване на CMV е ниска и нито едно от децата, предаващи CMV, не развива тежки симптоми в нашите институции, където се използва главно замразено мляко. Замразеното и размразеното кърма може да намали процента на вертикална CMV инфекция и сериозни заболявания, въпреки че в редки случаи този метод не може напълно да предотврати тежки симптоми, подобни на сепсис и некротизиращ ентероколит. 5