специфичен

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Суициден ефект на различни синтетични протеини на ТК
  • Специфична за сайта геномна интеграция в клетки HEK293, медиирана от интеграза phiC31
  • Специфична за мястото интеграция и изрязване на рекомбинази в първично изолирани говежди фетални фибробласти
  • дискусия
  • методи
  • Етично изявление
  • Плазмидна конструкция
  • Клетъчна култура и трансфекция
  • Уестърн петно
  • Анализ на цитотоксичността
  • Анализ на поточната цитометрия
  • Приготвяне на рекомбинантен клетъчно пропусклив протеин и протеинова трансдукция
  • Южен петно
  • Статистически анализ
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Селскостопанска генетика
  • Генното инженерство
  • Генетични вектори

абстрактно

Доставката на ген, медиирана от интеграза PhiC31, се използва широко в генната терапия и трансгенезата на животни. Въпреки това, случайни събития на интеграция се наблюдават при медиирана от phiC31 интеграция в различни видове клетки на бозайници; в резултат на това е нарушена ефективността на псевдо интеграцията на сайта и оценката на интеграцията, специфична за сайта. За да подобрим тази система, използвахме сливания ген attB-TK като негативен селекционен маркер, елиминирайки произволна интеграция по време на трансфекция, медиирана от phiC31. Също така избрахме система за селекция и плазмиден бактериален скелет, използвайки две други специфични за мястото рекомбинази, Cre и Dre. По този начин генерирахме чисти трансгенни говежди фетални фибробластни клетки без селекционен маркер и плазмид от бактериален гръбнак. Тези чисти клетки бяха използвани като донорни ядра за ядрен трансфер на соматични клетки (SCNT), което предполага подобна компетентност за развитие на SCNT ембрионите като нетрансгенни клетки. Следователно, сегашната система за доставка на гени улесни развитието на генната терапия и селскостопанската биотехнология.

PhiC31 интеграза е ДНК рекомбиназа, получена от фага Streptomyces φ C31 1. Този ензим може да медиира рекомбинация между две последователности, attB и attP 2, 3. PhiC31 интегразата не изисква перфектно съхранение на сайта attP, за да се постигне рекомбинация между местата attP и attB 4. Тези несъвършени attP сайтове или псевдо attP сайтове приличат на див тип 5 attP сайт и присъстват в транскрипционно активните области на геном 6. PhiC31 интеграза разпознава относително кратки, но леко специфични последователности в геноми на бозайници 7. По този начин, системата за интеграза phiC31 показва няколко характеристики, като местна специфичност и еднопосочна рекомбинация, и позволява успешното използване на интеграза в различни области на изследване, включително in vitro доставка на ген 5 или in vivo 8, генна терапия 9 и производство на трансгенни животни 10. .

Представихме подход, който използва отрицателна стратегия за подбор, за да се изключи случайната интеграция по време на трансфекция, медиирана от phiC31. Също така избрахме система за селекция и плазмиден бактериален скелет, използвайки две други рекомбинази, а именно Cre и Dre.

резултатът

Суициден ефект на различни синтетични протеини на ТК

(А) Схема на различни кондензирани конструкции на ТЗ. CMV: цитомегаловирус незабавен ранен промотор; loxP и rox: цели за разпознаване на рекомбинази Cre и Dre; attB35 и attBwt: минимален дробен размер и обща дължина на сайта от attB от див тип; G4S × 3: (Gly 4 Ser) 3 гъвкава връзка; P2A: саморазцепващ се 2A пептид, получен от свински тешовирус-1; ATG: инициационен кодон, фланкиран от конвенционалната последователност на Kozak; контрол: празен вектор pIRES2-AcGFP1-Nuc. (B) Western blot анализ на HEK293 клетки, трансфектирани с различни ТК конструкции. Петното се изследва с поликлонални антитела срещу HSV-1 TK или GAPDH. Звездите показват вероятни продукти на протеолитично разграждане. Блоковете с пълна дължина са показани на допълнителна фигура S8. (C) Имунофлуоресцентно оцветяване на клетки HEK293 48 часа след трансфекцията. Ядрата бяха оцветени с DAPI (синьо); ТК протеините (червени) се оцветяват с анти-ТК антитяло и се визуализират с Cy3-маркирани вторични антитела. Скала на скалата = 10 μm. (D) Относителна жизнеспособност на клетки HEK293, трансфектирани с различни ТК конструкции. Избраните от FACS трансфектирани клетки бяха изложени на различни концентрации на нуклеозидния аналог GCV в продължение на 4 дни. Цитотоксичността се определя с помощта на WST-1 анализа. "Контрол" представлява клетки, трансфектирани с празния вектор pIRES2-AcGFP1-Nuc.

Изображение в пълен размер

Извършен е анализ на цитотоксичността върху клетки HEK293, за да се изследва суицидния ефект на различни TK слити протеини. Резултатите показаха, че всички ТК конструкции с изключение на контролно трансфектирани клетки HEK293 са чувствителни към лечение с ганцикловир (GCV) при високи концентрации (Фигура 1D). За разлика от това, векторната контролна клетъчна линия, трансфектирана с pIRES2-AcGFP1-Nuc, е силно устойчива на 10 ug/ml GCV и показва 2,76% клетъчна смърт. При 0,1 μg/ml GCV, 51,1 ± 4,0% от клетките са мъртви в трансфектираната група attBrP2ATK в сравнение с 28,5 ± 7,7% (P = 0,001) и 34,8 ± 4,5% (P = 0,032) клетъчна смъртност в attBrTK- и attBrG4STK. - трансфектирани клетки след период на лечение от 4 d. Този резултат показва, че клетките, трансфектирани с attBrP2ATK, са по-чувствителни към GCV, отколкото другите две клетки, трансфектирани с TK конструкцията, слети към attB при относително ниски концентрации на GCV. За сравнение, клетките, трансфектирани с attBrP2ATK, показват подобна жизнеспособност като клетките, трансфектирани с attB35TK и wt-TK, в които протеинът от див тип се експресира и в двете групи. Следователно, ние избрахме attBrP2ATK като представителна конструкция на TK, слята с attB с пълна дължина за следващите изследвания.

Специфична за сайта геномна интеграция в клетки HEK293, медиирана от интеграза phiC31

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

Специфична за мястото интеграция и изрязване на рекомбинази в първично изолирани говежди фетални фибробласти

Промоторът CMV е заменен с промотор CAGGS, за да се поддържат високи нива на експресия на TK трансген. Резултатът беше създаването на плазмиден интеграционен вектор pCAG-attBrP2ATK (Фигура 2А). Също така добавихме рок и loxP фланкиран сайт за множествено клониране (MCS), за да въведем желаните гени (GOI), и след това заменихме IRES-AcGFP-Nuc касетата с EGFP-експресираща касета, задвижвана от промотора EF1α. За да определим ефективността на експресията на новогенерирания интеграционен вектор, ние временно трансфектирахме клетки HEK293, използвайки TK конструкции, задвижвани или от CMV промотор, или от CAGG промотор. Western blot анализът показва, че ТК продуктът се изразява силно под промотора на CAGGS (Допълнителна фигура S2A). Клетките се наблюдават чрез флуоресцентна микроскопия 48 часа след трансфекцията. Трансфектираните с pCAG-attBrP2ATK клетки HEK293 показват силен флуоресцентен GFP сигнал (Допълнителна фигура S2B). Този резултат предполага подходяща функция за промотора EF1a. Следователно, pCAG-attBrP2ATK се използва в по-нататъшни експерименти, което вероятно води до силна експресия на трансген в първично изолирани клетки.

Изображение в пълен размер

Еднократно безопасно пристанище от интегрирани чисти трансгенни клетки без селективни маркери и изрязан векторен скелет бяха използвани като ядрени донори за получаване на SCNT трансгенни ембриони. В допълнение, нормални фетални говежди фибробласти, получени от същия плод и подобен номер на пасаж, бяха използвани като контрол за изследване на ефекта от трансгенните процедури върху потенциала за развитие на SCNT ембрионите. Когато изрязаните клетки бяха използвани като ядрени донори в сравнение с нетрансфектираните говежди фетални говежди фибробластни клетки, не се наблюдават значителни разлики в скоростта на разцепване и образуване на бластоцисти (77, 4 ± 2,6% срещу 78,6 ± 4,3%, P = 0,7 при скорост на разцепване; 32,6 ± 2,9% срещу 36,3 ± 4,0%, P = 0,3 за степента на образуване на бластоцисти). Подобни нива на бременност са наблюдавани и след ембриотрансфер в сравнение с контролната група (25,9 ± 2,4% срещу 32,3 ± 4,7%, Р = 0,1).

дискусия

Въведохме нова стратегия, която може да се използва за избор на псевдо-специфична интеграция, медиирана от phiC31, от произволна интеграция и за получаване на чисти трансгенни клетки без селективни маркери и векторна опора. Използвахме интеграза phiC31, за да постигнем специфична за сайта геномна интеграция в псевдосайтове. Използвахме също слети протеини attB-TK като маркери за отрицателна селекция, за да изключим случайната интеграция. Чисти трансгенни клетки се получават чрез флуоресцентно активирано клетъчно сортиране след третиране с Cre- и Dre-рекомбиназа.

И накрая, това проучване представя проста, медиирана от phiC31 стратегия за интегриране на трансгена в безопасно геномно пристанище чрез предотвратяване на произволна интеграция и комбиниране на трансдукция на клетъчно пропускливи протеини и сортиране на активирани от флуоресценция клетки, за да се премахне селекционната система и гръбначния стълб на вектора. Този невирусен подход осигурява проста и безопасна алтернатива за производството на чисти трансгенни клетки без маркери за селекция и плазмиден бактериален гръбнак. Следователно, нашата стратегия е ценен инструмент в генната терапия и трансгенезата при животни.

методи

Етично изявление

Експерименталната процедура е одобрена от Комисията за грижа за животните в Колежа по ветеринарна медицина към Северозападния университет A&F в Китай. Яйца от говеда от заклани зрели крави са събрани от кланица Tumen (Xi'An, Китай). Новородените женски телета от Холщайн са използвани за получаване на клетъчни култури на ядрени донори, а кравите от говеда Angus (Yangling Keyuan Cloning Co., Ltd., PR China) са използвани като приятни животни.

Плазмидна конструкция

Генерирани са множество конструкции на TK синтез, както е описано в ДОПЪЛНИТЕЛНИ МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ (Фигура 1А). Последователностите на праймерите, рестрикционните сайтове и шаблоните, използвани в изследването, са изброени в таблица SI.

Клетъчна култура и трансфекция

Клетките HEK293 се отглеждат в модифицираната от Dulbecco среда на Eagle (DMEM; GIBCO, Карлсбад, Калифорния), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; GIBCO) при 37 ° C в овлажнена атмосфера с 5% CO 2. Фетални говежди фибробласти са изолирани от плода на Холщайн (на възраст 50-60 дни; Yangling Keyuan Biotechnology Inc., Китай) чрез разделяне на обезглавеното тяло и вътрешностите; След това фибробластите се култивират в DMEM, допълнен с 10% FBS при 38,5 ° С в овлажнена атмосфера с 5% CO 2. Говежди фетални фибробласти при вливането се събират чрез трипсинизация и се подлагат на пасаж или криоконсервация.

Клетъчната трансфекция се извършва, както е описано по-рано 20. Накратко, HEK293 клетки или фетални говежди фибробласти бяха ресуспендирани в 0.2 ml разреден работен буфер за електропорация, съдържащ само донорен плазмид (5 μg) или донорен плазмид (5 μg) с phiC31 иРНК (1 μg). Електропорацията се извършва с помощта на BTX ECM2001 (BTX, Сан Диего, Калифорния), настроен за един импулс от 2 ms при 510 V. 24 часа след електропорацията клетките се разреждат в 10 cm съд, съдържащ прясна среда, допълнена с G418 (400 μg)/ml до 600 μg/ml) или G418/GCV (400 μg/ml до 600 μg/ml и 1 μg/ml до 10 μg/ml) за селекция на стабилно трансфектирани клетки. Изборът се извършва в продължение на 12 до 15 дни, докато се събират и преброяват отделни колонии.

Уестърн петно

Експресията на тимидин киназа протеин се открива чрез Western blot. Клетъчните лизати бяха получени от HEK293 клетки, трансфектирани с празен векторен контрол (pIRES2-AcGFP1-Nuc) или различни ТК конструкции (attB35TK, attBrTK, attBrG4STK, attBrP2ATK и wt-TK). 48 часа след трансфекцията, клетките се събират и ресуспендират във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Общият протеин (10 μg) се зарежда върху единична лента върху 12% SDS-PAGE гел. Гелът се прехвърля в мембрани от поливинилиден флуорид (Millipore, Billerica, МА) и се подлага на Western blot анализ съгласно стандартния протокол. Кози поликлонални антитела срещу HSV-1 тимидин киназа (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта Круз, Калифорния) и маркиран с HRP Donkey Anti-Goat IgG (H + L; 1: 1000; Beyotime, Jiangsu, China). са били използвани за откриване на ТК продукти. Заешко поликлонално антитяло срещу GAPDH (1: 1000, Sigma) и маркиран с HRP кози анти-заешки IgG (H + L; 1: 1000; Beyotime) бяха използвани за откриване на GAPDH, което беше използвано като вътрешен контрол.

Анализ на цитотоксичността

Клетките HEK293 бяха трансфектирани с различни ТК конструкции в отсъствие на интеграза phiC31. Трансфектираните клетки се определят чрез експресия на GFP и се сортират чрез FACS, извършена на 48 h след трансфекцията. Сортираните GFP-положителни клетки бяха засяти в 96-ямкови плаки при клетъчна плътност 5.0 × 10 3 клетки/ямка. Към трансфектираните клетки се добавят концентрации на GCV (0, 0.01, 0.1, 1, 10 и 20 μg/mL). След 4 дни убиващият ефект на GCV се измерва, като се използва WST-1 клетъчен комплект за анализ на пролиферация и цитотоксичност (Beyotime), съгласно инструкциите на производителя.

Анализ на поточната цитометрия

На 2 или 5 дни след трансфекцията, 2 × 10 7 клетки от всяка култура, трансфектирани само с TK кондензирани конструкции, или TK кондензирани конструкции и phiC31 mRNA бяха събрани чрез трипсинизация и отново суспендирани в PBS, съдържащ 2% FBS. След това клетките бяха анализирани чрез поточна цитометрия, за да се определи експресията на GFP. Провежда се цитометричен анализ с помощта на BD FACSAria (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния).

Приготвяне на рекомбинантен клетъчно пропусклив протеин и протеинова трансдукция

pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS плазмидите бяха конструирани чрез клониране на последователността TAT-Dre-NLS в His6 експресионен вектор pET-28a (+). Експресионният вектор pET-28a (+) - His-NLS-TAT-Cre 20 и pET-28a (+) - His-TAT-Dre-NLS бяха използвани за трансформация на щам Escherichia coli BL21 (DE3) отделно за IPTG-индуцируема експресия на His-маркирани протеини Cre и Dre. Експресията и пречистването на His-маркирани Cre и Dre протеини се извършват съгласно подробния протокол, описан по-рано 20. Концентрациите на протеини се измерват с помощта на BCA комплект за анализ на протеин (Beyotime). За експерименти с трансдукция на протеини 2 × 106 клетки се засяват на 24-ямкова плака и се отглеждат в продължение на 24 часа. Клетъчно-проникващите протеини се стерилизират чрез филтриране с помощта на 0,22 μm филтър (Millipore). Клетките се инкубират в продължение на 4 часа в среда, съдържаща 100 μg/mL His-NLS-TAT-Cre и 100 μg/mL His-TAT-Dre-NLS протеини. След трансдукция клетките се измиват с PBS и се култивират в продължение на още 72 часа в нормална среда, преди да се проведе поточен цитометричен анализ.

Южен петно

Приблизително 10 μg до 20 μg геномна ДНК от нетрансфектирани клетки или стабилно трансфектирани клетъчни колонии се усвоява с BamHI и HindIII (New England Biolabs, Пекин, Китай) за една нощ и се решава чрез електрофореза в агарозен гел. ДНК беше прехвърлена, подложена на UV кръстосано свързване върху найлонова мембрана Hybond N + (Roche, Южен Сан Франциско, Калифорния) и хибридизирана с TK сонда или неопроба, генерирана с помощта на DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit II (Рош). Последователностите на праймера бяха изброени, както следва: за ТК сонда, 5′-CAGCAAGAAGCCACGGAAGT-3 ′ (напред) и 5′-GCCCGAAACAGGGTAAATAACG-3 ′ (обратно); за нео-сонда, 5′-GGATTGCACGCAGGTTCTCCG-3 ′ (напред) и 5′-CGCCGCCAAGCTCTTCAGCAA-3 ′ (назад).

Статистически анализ

Всеки експеримент се извършва поне 3 пъти. Данните бяха анализирани с помощта на SPSS 20.0 (IBM Corporation, Somers, NY, USA) с еднопосочни ANOVA и тестове за най-малко значима разлика. Данните се отчитат като средна стойност ± SEM. P