абстрактно
Основното
Челюстно-лицевите фиброзни лезии включват група от нарушения на лицето и челюстта, характеризиращи се с заместване на костите с доброкачествена съединителнотъканна матрица с различни количества минерализирани вещества. Осмотичният фиброма и фиброзната дисплазия са най-често срещаните фиброзни лезии, които могат да бъдат свързани със значителни козметични и функционални нарушения; тъй като те показват различни модели на прогресиране на заболяването, важно е да се прави разлика между тях. Поради риска от рецидив, осифициращият фиброма трябва да бъде напълно енуклеиран от околната кост. 1, 2, 3 За разлика от това, пациентите с фиброзна дисплазия трябва да бъдат лекувани според клиничното състояние. Растежът на моностотичната фиброзна дисплазия обикновено има тенденция да се стабилизира при достигане на зрялост на скелета; Следователно операцията при деца и юноши трябва да бъде отложена възможно най-скоро. 1, 2, 3, 4 Бисфосфонатната терапия се използва при пациенти със симптоматична фиброзна дисплазия. Типичните случаи на вкостяване на миома и фиброзна дисплазия на лицето и челюстта се характеризират с рентгенологичен и хистологичен вид. Тези лезии обаче често представляват диагностична дилема поради несигурност по отношение на диагностичното значение на специфични рентгенологични и хистологични характеристики; следователно точната диагноза на тези лезии може да бъде трудна. 1, 2, 3
Хистологично стромалните фибробласти произвеждат костен матрикс без морфологични данни за остеобластични клетки по периферията на костните спикули при фиброзна дисплазия. 4 Ултраструктурните и биохимични проучвания показват, че фибробластният компонент на фиброзната дисплазия е свързан с остеогенната линия; 7, 8, но все още не са предоставени точни молекулярно-биологични доказателства за тази цел. Напоследък е доказано, че остеогенната диференциация от мезенхимни стволови клетки се дължи на транскрипционния фактор Runx2. 9, 10 Следователно, разликите в експресията на Runx2 и други остеогенни маркери могат да позволят хистологично разграничаване между фиброзна дисплазия и осмотичен фиброма.
В лезионните тъкани на пациенти със синдром на McCune-Albright е идентифицирана мутация в точката на активиране на алфа субединицата на гена на стимулиращия G протеин (GNAS) в кодона Arg201. Впоследствие се наблюдават мутации на GNAS при екстрагнатична фиброзна дисплазия без синдром на McCune-Albright, 12, 13, 14, 15, която я разпознава като маркер на фиброзна дисплазия. Наличието или липсата на GNAS мутации при дисплазия на гататична фиброза не е проучено.
В това проучване анализирахме експресията на остеогенни маркери и GNAS мутации в случаи на дисплазия на фиброза на комари и осификация на миома с типични рентгенологични и хистологични характеристики, за да идентифицираме важни маркери, които позволяват диференциация между двете заболявания.
Материали и методи
Експериментални субекти
Девет проби от фиброзна дисплазия, пет от осифицираща миома, две от остеофибриална дисплазия и три от нормални кости бяха декалцифицирани в разтвор на EDTA, фиксирани във формалин и вградени в парафин. Използваните в това проучване тъканни проби са получени съгласно насоките на Съвместната комисия за клинично изследване на следдипломния факултет по стоматология и медицина към университета в Осака. Девет фиброзни дисплазии включват пет моностотични случая на гнатик и три случая на моностоза и еднополиостотични екстрагнати. И петте случая на вкостяване на миома са получени от областта на комарите. Всички тези лезии са диагностицирани като типични случаи въз основа на клинични, рентгенологични и хистологични критерии. Клиничните данни, свързани с тези случаи, са обобщени накратко в Таблица 1. Хистологичните срезове на тези проби, нарязани на 5 μm, са оцветени с хематоксилин и еозин и подложени на имунопероксидазната процедура.
Маса в пълен размер
имунохистохимия
Имунохистохимичното оцветяване се извършва чрез метод на пероксидаза на стрептавидин-биотин комплекс (sABC) с анти-мишка или анти-заешка sABC система от Dako (Glostrup, Дания). Основните антитела, използвани в това проучване, са както следва: миши анти-Runx2 моноклонални антитела (MBL Co., Ltd., Нагоя, Япония), 16 заешки анти-дентинови матрични протеини 1 (DMP1) поликлонални антитела, 17 миши анти-говежди остеокалцин моноклонални антитела (клон; OC4-3) (TaKaRa Biomedicals, Shiga, Япония) и заешки анти-миши поликлонални анти-остеопонтинови антитела (IBL Co., Ltd., Gunma, Япония). Възстановяването на антигена се извършва чрез смилане на трипсин до имунооцветител остеокалцин и DMP1 и нагряване с цитратен буфер към имунооцветяване Runx2 и остеопонтин. Секциите леко контрастираха с метилово зелено. Миши или заешки IgG серум (Dako) се използва като първично антитяло като отрицателна контрола, което дава еднакви отрицателни резултати.
Полиморфна полимеразна верижна реакция - Дължина на ограничение (PCR-RFLP)
последователност
Амплифицираните с 88 bp вложени PCR продукти с PNA праймера се пречистват чрез 2% агарозна гел електрофореза. Лентите се изрязват и изолират от гела чрез комплекти за екстракция на ДНК (QIAGEN). Изолираната ДНК се субклонира в pGEM-T Easy вектора (Promega Co, Madison, WI, USA). След пречистване се извършва секвениране, като се използват векторни праймери SP6 и T7. Десет клонинги на лезия бяха анализирани с помощта на автоматизиран модел на ДНК секвенсор 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). По този начин, всички PCR амплифицирани продукти бяха секвенирани, за да се потвърди присъствието на мутацията.
резултатът
Клинико-патологични и рентгенологични находки на пациенти
Клиничните данни за пациенти с фиброзна дисплазия и осифициращ фиброма са показани в Таблица 1. Девет фиброзни дисплазии и пет осифициращи фиброми, представени като уголемяване на засегнатите кости и пет дисплазии с фиброзна фиброза и пет осифициращи фиброми показват лицева асиметрия. Рентгенологичната дисплазия с финаза на комарите показва хомогенна радиоактивна непрозрачност със смляно стъкло, смесващо се в околната нормална кост (Фигура 1а), докато осифициращата фиброма се появява като едномокуларна смесена радиоактивна и радиоактивна непрозрачна лезия с рязко определени граници (Фигура 1г). ). Хистологично фиброзната дисплазия на комарите е съставена от тъкан с кости с неправилна форма във васкуларизирана фиброзна строма с променлив целулит (Фигура 1б и в). Тъканите костни спикули са равномерно разпределени по цялата лезия и показват различни форми (Фигура 1б и в). Осмотичните фиброми показват видни калцифицирани структури (кубчета и циментоли), които се появяват като еозинофилни или базофилни остеоидни или костни сфероиди в средната клетка, плътна строма (Фигура 1е и f). По този начин в това проучване са използвани лезии, които отговарят на техните типични клинични, рентгенологични и хистологични критерии.
Изображение в пълен размер
Имунохистохимични находки на фиброзна дисплазия и осмотичен фиброма
Имунохистохимичните находки от екстрагнатична и комарна фиброзна дисплазия и осмотичен фиброма са показани на Фигура 2. И при фибративните дисплазии, и при осифициращите фиброми се наблюдава оцветяване на Runx2 в клетъчните ядра на вретеното във влакнести съединителни тъкани, както и в клетки на повърхността на минерализираните клетки. структури (Фигура 2а - в). По същия начин, остеопонтин е открит около периферията на калцирани структури и в двете лезии (Фигура 2г - е). Силната имунореактивност срещу остеокалцин се разпределя в калцифицирани структури при фиброзна дисплазия (Фигура 2g и h), докато само слаба имунореактивност се вижда при осмотичен фиброма (Фигура 2i). DMP1 присъства конкретно в калцифицирания матрикс, заобикалящ остеоцитоподобни клетки, както при фиброзна дисплазия, така и при осмотичен фиброма (Фигура 2j-1). По този начин няма значителна разлика между фиброзна дисплазия и осмотичен фибром в разпределението на костния матрикс на който и да е тестван протеин, с изключение на остеокалцин.
Изображение в пълен размер
Откриване на мутация на GNAS при фиброзна дисплазия и при изолирани фиброми чрез PCR-RFLP
ДНК проби от нормална кост (Фигура 3а, платна 1-3, 7-9) и остеофибриална дисплазия (Фигура 3а, линии 4, 5, 10, 11) бяха използвани като отрицателни контроли. 18 Когато се извършва PCR без PNA, в отрицателни контроли се генерира 88-bp амплифициран фрагмент. Чрез добавяне на PNA към PCR, интензивността на амплифицираните ленти беше намалена с приблизително 40 до 60%. След третиране с Eag I, амплифицираните 88-bp фрагменти се усвояват напълно в два фрагмента от 74 и 14 bp, независимо дали е налице или не PNA (Фигура 3а, линии 1-5, 7-11). По-нататъшен анализ на последователността не разкрива мутация на GNAS в тези ДНК проби (данните не са показани).
Изображение в пълен размер
ДНК проба от парафиновия блок на екстрагнатична полиостотична фиброзна дисплазия (пациент # 3) беше използвана като положителна контрола. При липса на PNA, неразкъсани 88-bp и 74-bp ленти, съответстващи на мутантни и диви типове алели, бяха видими след разграждането на Eag1 (Фигура 3а, път 12). В присъствието на PNA след разцепването на EagI се виждаше само разцепената 88-bp лента, а не разцепената 74-bp лента (Фигура 3а, лента 6). Тези резултати показват селективно усилване на мутантни алели в присъствието на PNA. 20.
PCR анализът е извършен за четири екстрагнатични фиброзни дисплазии, пет фиброзни фиброзни дисплазии и пет осмотични фиброми. Във всичките девет случая на екстрагнатична или финална дисплазия на комари, фрагменти от 88 bp, усвоени с Eag I, не се усилват (Фигура 3b, пътеки 1-4: екстрагнатична фиброзна дисплазия; 5-9: фиброзна дисплазия на комари). За разлика от това, третирането на Eagle с пет проби осифициращ фиброма доведе до пълно разцепване на фрагменти 74 и 14 bp (Фигура 3b, платна 10 до 14). Анализът на последователността разкрива мутации на GNAS в кодона Arg201 във всичките девет случая на фиброзна дисплазия, но в нито една от осифициращите фибромни проби (Таблица 1).
дискусия
Осифициращият фиброма и фиброзната дисплазия често представляват диагностична дилема както за лекарите, така и за патолозите поради тяхното рентгенографско и хистологично сходство. Voytek и сътр. 21 съобщава, че значителните осмотични фиброми са напълно неразличими от фиброзна дисплазия от техните хистологични изследвания. Тези лезии също показват значително рентгенографско припокриване. 21 Те предположиха, че поради това сходство осифициращият фиброма и фиброзната дисплазия могат да се разглеждат като заболявания в двата края на един морфологичен спектър. Друг доклад гласи, че осифициращият фиброма е вариант на фиброзна дисплазия, а не различно заболяване. Това проучване ясно демонстрира, че имунохистохимичният анализ на остеокалцин и PCR анализът на мутациите на GNAS са полезни методи за разграничаване между двете и в допълнение предполага, че те вероятно са различни заболявания.
Фиброзната дисплазия се характеризира хистологично със стромални фибробласти, продуциращи костен матрикс без морфологични данни за остеобластични клетки в периферията на костните спикули. Остеобластната природа на тези фибробластни клетки се предполага чрез анализ на електронна микроскопия, който показва лигавицата на анормални остеобласти с подобен фибробласт около незряла тъкан, 7 и биохимичен анализ, който показва увеличаване на алкалната фосфатазна активност в клетките, които запълват фиброзни области. фиброзна дисплазия. В това проучване ядрата на фибробластните клетки, както и клетките на костната повърхност, показват силна експресия на Runx2, важен транскрипционен фактор за остеогенната линия, което предполага, че тези клетки са остеогенни предшественици. По същия начин фибробластните клетки в осифициращия фибром също показват силна експресия на Runx2 в ядрото. По този начин и двете лезии могат да се интерпретират като клетъчни заболявания в остеогенната линия.
Имунохистохимичният анализ на остеогенни маркери като остеопонтин и DMP1 не показва голяма разлика между фиброзна дисплазия и осмотична фиброма; остеокалциновата имунохистохимия обаче показва значителна разлика между двете. Остеопонтин, остеокалцин и DMP1 са изобилие от неколагенови протеини на нормалната костна матрица. 23, 24, 25 Остеокалцинът, най-разпространеният неколагенов протеин 24, се разпределя в нормалната кост 25 и е доказано, че е отрицателен регулатор на костното образуване чрез технологията за генно избиване. Изобилието на остеокалцин при фиброзна дисплазия и неговият дефицит при осифицираща фиброма предполагат, че калцифицираният материал при фиброзна дисплазия е по-подобен на нормалната кост, отколкото при осифициращата фиброма. Тази забележима разлика може да показва разлики в костната формация и диференциацията на остеобластите между двете лезии.
Анализът на мутациите на GNAS при кодона Arg201 се оказа полезен при разграничаването между осифициращата фиброза и фиброзна дисплазия. Соматичният характер на мутациите при фиброзна дисплазия затруднява идентифицирането им, тъй като мутациите не присъстват във всички клетки на засегнатите пациенти, дори в засегнатите органи. Следователно в това проучване е използван методът на PNA-затягане. 15, 20 Последователността на PCR-амплифицирани фрагменти потвърждава точността на PCR анализа с използване на PNA, което предполага, че PCR анализът, използван в това проучване, може да бъде полезен и леснодостъпен начин за откриване на мутации на GNAS в кодона Arg201. .
Наскоро бяха публикувани промени в туморния супресорен ген HPRT2 в осмотичния фиброма. Директното секвениране на HPRT2 разкрива мутации в два от четирите случая на осификация на миома. Тези открития предполагат, че мутацията на HPRT2 не е често срещана при развитието на осифициращ фиброма и следователно не може да се използва като маркер за диагностика.
В заключение, фиброзната дисплазия и осифициращият фиброма са подобни болестни образувания, тъй като и двамата показват маркери, съответстващи на остеогенната линия в техните стромални фибробластоподобни клетки. Те обаче се различават по точния състав на костния матрикс, както се вижда от имунохистохимията на остеокалцин. И накрая, PCR анализ с PNA за GNAS мутации в кодона Arg201 е потенциално полезен метод за разграничаване между двете.