енергията

  • елементи
  • абстрактно
  • ЗАДЕН ПЛАН:
  • ЦЕЛТА:
  • методология:
  • резултатите:
  • заключение:
  • Въведение
  • Материали и методи
  • звяр
  • диета
  • Експериментален протокол
  • Съдържание на тъканни протеини и биохимични измервания
  • Изотопни измервания
  • Генната експресия
  • статистика
  • резултатът
  • Прием на храна, растеж на животни и състав на тялото
  • Плазма урея, хормони и аминокиселини
  • Състав на тъканите, скорост на протеинов синтез и генна експресия на протеолитичния път
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителна информация

елементи

  • метаболизъм
  • Затлъстяване
  • протеолиза

абстрактно

ЗАДЕН ПЛАН:

Диетите с високо съдържание на протеини (HP) по време на ограничаване на енергията са широко проучени за способността им да намаляват телесните мазнини и да поддържат чиста телесна маса, но малко се знае за ефекта им върху метаболизма на протеините в чистите тъкани.

Да се ​​определи ефектът от ограничаването на енергията и приема на протеини върху протеиновия анаболизъм и катаболизма при плъхове.

методология:

В продължение на 5 седмици 56 мъжки плъхове Wistar са хранени с диета, предизвикваща затлъстяване (OI). След това те бяха подложени на 40% ограничаване на енергията, използвайки OI диета или балансирана HP диета в продължение на 3 седмици, докато контролната група беше хранена с OI диета ad libitum (n = 8 на група). НР-ограничените плъхове бяха разделени на пет групи, които се различаваха само по източник на протеин: общ млечен протеин, казеин (C), суроватка (W), смес от 50% C и W и соя (n = 8). След това животните се жертваха в постпрандиално състояние и се определяше телесният им състав. Скоростта на протеинов синтез се определя в черния дроб, стомаха и бъбреците, като се използва подкожна доза от 13 С валин. MRNA нивата са измерени за ключови ензими, участващи в трите протеолизни пътя.

резултатите:

Енергийните ограничения, но не и съставът на диетата, повлияха на загубата на тегло и затлъстяването, докато теглото на чистата тъкан (с изключение на бъбреците) не се повлия от състава на диетата. Нивата на неоглюкогенни аминокиселини са склонни да падат под енергийната граница (P 1, 2 включват различни нива на ограничаване на енергията и модификация на енергийното съдържание на хранителни вещества в диетата, като намаляване на консумацията на мазнини или въглехидрати (СНО) и увеличаване на съдържанието на протеини. 3, 4 Протеините се фокусираха върху специфично проучване поради техния насищащ ефект, който може да намали енергийния прием 5 и да увеличи спазването на диетата от пациентите. 6, 7 В допълнение, богата на протеини диета може да сведе до минимум загубата на мускулна маса, наблюдавана при ниска -калорична диета

Ефектите от ограничаването на енергията върху анаболните и катаболните потоци не са достатъчно известни и наличните открития, които се различават по отношение на много параметри (модел, продължителност, степен на ограничение), не са сравними. Едно проучване на хора наскоро показа, че синтеза на мускулен протеин е намален след леко намаляване на енергията. 12 Допълнителни данни бяха получени при плъхове и разкриха неблагоприятни ефекти от ограничаването на енергията върху анаболизма на мускулния протеин в зависимост от мускулния тип (солеус, гастрокнемиус, плантарис, тибиалис отпред) и протеини (саркоплазмен или митохондриален). 13, 14, 15 В допълнение, анаболизмът на протеините не е проучен в други органи, като черния дроб или бъбреците, докато ad libitum наблюдава, че протеиновият синтез в черния дроб и бъбреците се модулира от хранителните нива на протеини, за разлика от мускулния синтез. . 16, 17 Изследванията на ефекта на ограничаването на енергията върху протеолизата са редки и, за разлика от проучванията на синтеза на протеини, включват черния дроб 18, 19, но нито мускулите, нито бъбреците. Следователно изглежда необходимо да се изяснят последиците от ограничаването на енергията върху протеиновите потоци в зависимост от диетичния състав и по-специално съдържанието на протеини.

Целта на това проучване беше да се разберат по-добре ефектите от диетичния състав на макронутриентите, включително източника на протеин, върху телесния състав и метаболизма на тъканните протеини по време на ограничаване на енергията при плъхове.

Материали и методи

Всички експерименти бяха проведени в съответствие с насоките на Френския комитет за грижа за животните и Европейската конвенция за гръбначните животни, използвани за експериментите. Мъжки плъхове Wistar (n = 56, 300-320 g) са закупени от Harlan (Horst, Холандия) и са настанени при контролирани условия на околната среда (температура, тъмен период от 12 часа, започвайки в 08:30). Плъховете са имали свободен достъп до вода и търговска лабораторна чау в продължение на 5 дни преди началото на диетичната адаптация към експерименталната диета.

диета

Общо 56 плъхове са хранени с диета, предизвикваща затлъстяване (OI) ad libitum в продължение на 5 седмици (12% енергия като протеин, 43% като CHO, 44% като мазнини) и след това разделени на седем различни групи в продължение на 3 седмици (n = 8 на група). Контролната група беше държана на същата диета ad libitum в продължение на 3 седмици. OI-R плъховете получават OI диета с енергийно ограничение от 45%, докато други плъхове са енергийно ограничени с високо протеинова (HP-R) диета (33% енергия като протеин, 37% като CHO и 30% като мазнини). При HP-R плъхове бяха тествани пет различни протеинови източника: млечни протеини (MP), суроватка (W), казеин (C), смес от C и W в същото съотношение (CW) и соя (S). Изчислената енергия, доставена в ограничената група, осигурява 55% от средния енергиен прием, наблюдаван през последните 2 седмици на индукция. Допълнителна информация за дизайна на изследването е достъпна на уебсайта Int J Obes (Фигура S1). Общият MP е източникът на диетични протеини IO и IO-R (Таблица 1). По отношение на състава, HP-R диетите са представителни за диетите за отслабване, често използвани при хора. Диетите OI-R и HP-R са допълнени с минерали и витамини, за да се избегнат недостатъци поради ограничаване на енергията.

Маса в пълен размер

Диетите се доставяха в полутечна форма, за да се предотврати разливането и да се подобри записването на приема. През последната седмица на ограничителния период плъховете бяха използвани за храна по модел, състоящ се от първи период между 8:30 и 9:30, доставящ 1/3 от дневната доза и втори период между 12:00 и 18: 00 доставяне на останалата доза. OI плъховете бяха подложени на същия график, но имаха свободен достъп до храна между 12:00 и 18:00. Този модел беше приет така, че животните да ядат стандартно хранене напълно в рамките на 1 час на експерименталния ден.

Експериментален протокол

Телесното тегло и приема на храна на плъховете се измерват ежедневно през първите 3 дни и след това на всеки 2 дни. На 56-ия ден плъховете се хранят с калибрирано хранене, съответстващо на 1/3 от дневната доза 2 часа преди умъртвяването. За да се измери скоростта на синтеза на протеинова фракция (FSR), животните се инжектират подкожно с 300 μmol kg-1 BW от наводняваща доза L- (1-13C) -валин (50% мол., Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA) ). минути преди убийството. Животните се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на натриев пентобарбитал (50 mg kg-1 телесно тегло). След разрязване на корема се взема кръв от кухата вена в пълни EDTA епруветки и се центрофугира за измерване на плазмените метаболити и хормони. След това плъховете се жертват чрез разкъсване на каудалната куха вена и аортата. При стерилни условия черният дроб, бъбреците и мускулите на стомаха бяха отстранени, изплакнати, претеглени и замразени до анализ. Далакът, мускулът на далака, червата и стомаха също са били взети под внимание. Коремните мастни накладки (епидидимални, мезентериални и ретроперитонеални) бяха изрязани и ингвиналната подкожна мастна подложка беше отстранена. Трупът беше отстранен, за да се оцени чистата телесна маса. Теглото на всички тези тъкани беше записано.

Съдържание на тъканни протеини и биохимични измервания

Тъканите бяха лиофилизирани и претеглени. Общото им съдържание на N се определя по метода на Дюма, като се използва елементален анализатор (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Милано, Италия) с атропин като стандарт.

Общото съдържание на протеин (g) в тъканите се определя като P = TM x% DM x% N x 6, 25/10 000, където TM е мокрото тегло на тъканта (g) и DM в сухо вещество.

Плазмените концентрации на аминокиселини се определят върху депротеинизирани плазмени проби, като се използва йонообменна хроматография с дериватизация на нинхидрин чрез колона (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Франция). Концентрациите на инсулин и лептин бяха анализирани с помощта на ендокринен панел на плъхове (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, USA) в система Bioplex 200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Концентрациите на урея бяха определени с помощта на търговски комплект (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Франция).

Изотопни измервания

FSR (% на ден) на тъканните протеини се изчислява като FSR = Ebound val/(Efree val × t) x 100, където Ebound val и Efree val са протеинови връзки и обогатени 13 C-валини в тъканите. Абсолютните скорости на синтез (ASR, g на ден) бяха изчислени като ASR = FSR x P, където P е общото съдържание на протеин в тъканта. Общата мускулна маса се оценява на 45% от телесното тегло. 20.

Генната експресия

Общата РНК беше извлечена от замразена тъкан, използвайки реактиви TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Общата концентрация на РНК се определя количествено при 260 nm и се използва оцветяване с етидиев бромид, за да се потвърди целостта на РНК. Синтезът на комплементарна ДНК на първа верига (cDNA) се извършва върху 400 ng РНК, като се използва комплект за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Франция) с PTC-200 термичен циклер (MJ Research, Waltham, MA, USA). PCR в реално време се извършва с помощта на "power syber green PCR master mix" (Applied Biosystems) върху 7300 PCR система в реално време (Applied Biosystems). Грундовете са проектирани с помощта на софтуера Oligo Explorer 1.1.0 (GeneLink, Hawthorne, NY, USA). Последователностите на използваните PCR праймери бяха: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(напред) и 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (в противен случай) за катепсин D (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTGACTACA-3 '(обратен) и 5' - GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3 '(реверс) за убиквитин (Ubb, NM_138895), 5'-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3' (напред) и 5'-ACACAACGACGATGGAAAG-3 '(назад) forAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG (NM_017116), 5'-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3 'и 5'-GGGTCGGGGGGTG-3' за 18S.

Всички PCR реакции се провеждат, както следва: денатурация при 95 ° С за 10 минути, 40 цикъла на усилване, всеки цикъл, състоящ се от 15 s при 95 ° C и след това 1 min при 60 ° C. Прагът на цикъла (CC) за всяка проба е определя се при постоянен праг на флуоресценция. Усилванията на рибозомната 18S РНК бяха използвани, за да се отчете променливостта в първоначалните количества на cDNA и вариациите между плаките бяха коригирани с помощта на RT калибратор.

Експресията на гена се определя с помощта на формулата 2-ACt, където 2 представлява оптималната ефективност на целевия PCR ген и ACt = Ct - Ct18S. PCR ефективността се определя във всяка плака чрез серийно разреждане на обратно транскрибираната РНК.

статистика

Данните са изразени като средно ± sd. Груповият ефект е анализиран чрез еднопосочен ANOVA (версия 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) и са извършени post-hoc тестове на Tukey за множество сравнения. Ефектите от ограничаването на енергията и нивото на протеини бяха анализирани с помощта на изявления за контраст в модела в OI групите и ограничените групи. Ефектът на протеиновия източник се анализира в HP-R групите. За кривите на растежа данните бяха анализирани, използвайки смесен модел с време като повтарящ се фактор. P

Растеж на плъхове по време на 5-седмичния период на ОИ и по време на ограничаване на енергията в продължение на 3 седмици. Средно ± sd (n = 8). За по-голяма яснота е посочена само една HP-R група, тъй като няма разлика между ограничените групи. * се различава значително от контролите (смесен модел с повтарящи се мерки, post hoc тест на Tukey). OI, контролните плъхове са хранени с OI ad libitum диета; OI-R, плъхове с ограничена енергия в OI диета; HP-MP-R, енергийно ограничени плъхове на HP диета, съдържаща общ MP.

Изображение в пълен размер

Съставът на тялото е бил повлиян от ограничаването на енергията, докато съставът на диетата с макронутриенти (т.е. ниво на протеин или източник на протеин) няма ефект (Таблица 2). Бъбреците бяха единственият орган, в който теглото на протеините се увеличи значително. Ограничаването на енергията намалява мастните накладки, докато слабите тъкани са само незначително засегнати от ограничаването на енергията. Няма разлика в телесния състав между различните ограничени групи, независимо от нивото и естеството на съдържанието на протеини в диетата им.

Маса в пълен размер

Плазма урея, хормони и аминокиселини

Плазмените метаболити и хормони са измерени 2 часа след хранене (Таблица 3). Уремията е била с 64% по-висока при HP плъхове, отколкото при плъхове с OI (P

Концентрации на аминокиселини в плазмата, които са били повлияни от енергийните ограничения, нивата на протеин и/или източника на протеин. Средно ± sd (n = 8). OI, контролните плъхове се хранят с OI ad libitum диета (черна линия); OI-R, плъхове с ограничена енергия в храната OI (бяла лента); HP-R, енергийно ограничени плъхове при HP диета (сиви ленти) с протеини от различни източници (MP; W; CW; C; S). Основните статистически ефекти са показани във всяка графика: ограничение на енергията (ER), ниво на протеин (PL), източник на протеин (PS).

Изображение в пълен размер

Състав на тъканите, скорост на протеинов синтез и генна експресия на протеолитичния път

Съдържанието на протеини, FSR и ASR в черния дроб, гастрокнемиума и бъбреците са показани в Таблица 4. Констатациите за всички HP-R групи са обединени поради липсата на ефект на източник на протеин. Ограничението на енергията и нивото на протеини не повлияват съдържанието на протеини и потоците на протеинов синтез в тези тъкани, както се оценява от FSR или ASR.

Маса в пълен размер

В черния дроб диетата не модулира експресията на катепсин D, убиквитин, Е2 ензим и m-Calpain (Фигура 3). За разлика от това, нивата на РНК гени, участващи в протеолитичните пътища, са значително увеличени от енергийното ограничение в бъбреците и намалени от нивата на протеини в диетите с ограничена енергия за всичките четири ензима. Ефектът на протеиновия източник се наблюдава и за убиквитин, ензим Е2 и М-калпаин, с тенденция към по-високо ниво на експресия в групата MP в сравнение с Cas и S. При гастрокнемиус мускулна протеолиза генна експресия на ензими (с изключение на катепсин D) има тенденция да се увеличава с ограничаване на енергията, докато нивата на HP драстично намаляват експресията на тези четири ензима.

Относителна експресия на гени на протеолитичен път (катепсин D, убиквитин, Е2 ензим, m-Калпаин) в черния дроб, гастрокнемиуса и бъбреците при плъхове след ограничаване на енергията в продължение на 3 седмици. Средно ± sd (n = 8). OI, контролните плъхове се хранят с OI ad libitum диета (черна линия); OI-R, плъхове с ограничена енергия в храната OI (бяла лента); HP-R, енергийно ограничени плъхове на HP диета (сиви ленти) с протеини от различни източници (MP; W; CW, смес от C и W; C; S). Основните статистически ефекти са показани във всяка графика: група, ограничение на енергията (ER), ниво на протеин (PL), източник на протеин (PS).

Изображение в пълен размер

дискусия

Това проучване показа, че при плъхове, подложени на енергийно ограничение от 40-45%, загубата на тегло и телесният състав са засегнати главно от енергийните ограничения, докато диетичният състав и източникът на протеин нямат значителни ефекти. Нивата на HP подобряват циркулиращата глюкоза и липидите в кръвта, докато ограничаването на енергията се намалява само от свободните мастни киселини. Нивата на HP противодействаха на тенденцията за увеличаване на циркулиращите неоглюкогенни аминокиселини поради ограничаване на енергията. Степента на протеинов синтез не се повлиява нито от енергийно ограничение, нито от диетични нива на протеини, докато в бъбреците и мускулите ключовите протеолизни ензими са свръхекспресирани с ограничение на енергията и недоекспресирани с увеличаване на нивата на протеин. Тези модулации на протеолитичните пътища обаче не повлияват загубата на мускули, независимо от съдържанието на протеини в храната.

В заключение, при възрастни затлъстели плъхове, подложени на 40% енергийно ограничение в продължение на 3 седмици, тяхното тегло и загуба на мазнини се определят само от приема на калории, независимо от състава на макроелементите. Чистата маса се запазва независимо от нивото на протеина и протеиновият метаболизъм се повлиява само леко, с изключение на протеолизните пътища в мускулите и бъбреците, където всяко активиране след хранене чрез ограничаване на енергията се противодейства от ниво на HP. И накрая, когато нивото на протеин беше високо, всички източници на протеин бяха еквивалентни по отношение на техните ефекти.