елементи

абстрактно

Конюгатите антитяло-лекарство (ADC) или имуноконюгатите се оказаха нов клас лекарства за целенасочена терапия на рак 1, 2. ADC е трикомпонентна система, в която терапевтично моноклонално антитяло (mAb) и мощно малкомолекулно цитотоксично лекарство са конюгирани чрез стабилен линкер. MAb специфично разпознава повърхностния антиген/рецептор върху раковите клетки, които блокират трансдукцията на сигнала. Междувременно комплексът ADC се интернализира в раковите клетки, където антитялото се разгражда и цитотоксичното лекарство се освобождава. Този уникален дизайн не само значително намалява страничните ефекти на цитотоксичните лекарства, но също така дава възможност за обогатяване на цитотоксичните лекарства в раковите клетки 3. Двата ADC brentuximab vedotin и adotrastuzumab emtansine са одобрени от FDA за лечение на лимфом и рак на гърдата 1. Понастоящем много ADC лекарства са в клинични изпитвания за лечение на рак 4 .

Бяхме очаровани от дизайна на ADC, попитахме дали подобна стратегия може да се използва за лечение на затлъстяване чрез насочване към метаболитни органи. Тъй като няма установени антитела, подходящи за дизайн на ADC, ние се насочихме към антисенс олигонуклеотиди (ASO) като потенциален заместител на антитела. ASO са модифицирани къси едноверижни ДНК молекули, които регулират генната експресия предимно в черния дроб и мазнините 5, 6, 7. ASO имат много ниска бионаличност в скелетния и сърдечния мускул, мозъка, панкреаса след системно приложение 6, 7, 8. Всъщност са положени значителни усилия за проектиране на модификации на ASO, за да се подобри проникването в органи, различни от черния дроб и мазнините 9. Това ограничение на ASO за лечение на неврологични, мускулни и сърдечни заболявания изглежда е изгодно при проектирането на ASO-лекарствени конюгати за целевата мастна тъкан и черния дроб за лечение на затлъстяване. Друго важно съображение при избора на ASO е, че подобно на клетъчното поемане на ADC, е доказано, че интернализацията на ASO е до голяма степен чрез ендоцитоза 10, 11 .

Увеличаването на енергийните разходи е основната стратегия за лечение на затлъстяването. Тиреоидният хормон Т3 е много мощен за увеличаване на основния метаболизъм и предизвикване на потъмняване на бялата мастна тъкан 12, 13. Загубата на тегло е основен симптом на хипертиреоидизъм при хората14. Въпреки това, тиреоидният хормон е противопоказан за лечение на затлъстяване поради системните му ефекти върху мозъка, сърцето и мускулите, които причиняват тревожност, сърдечна недостатъчност и загуба на мускулна маса 14. Тъй като ASO проникват много слабо в тези органи, ние предполагаме, че ASO-T3 конюгатите минимизират ефектите на хормоните на щитовидната жлеза в тези органи.

Друг е въпросът какъв линкер да се използва за конюгиране на ASO и T3. Избрахме сулфосукцинимидил 4- (N-малеимидометил) циклохексан-1-карбоксилат (Sulfo-SMCC), неразграждащ се и непроницаем за мембрани омрежител поради своята висока селективност, кинетика на бърза реакция и съвместимост с водни реакционни условия., Sulfo-SMCC съдържа аминореактивен N-хидроксисукцинимид (NHS естер) и сулфхидрилна реактивна малеимидна група. Сулфо-SMCC малеимидната група е необичайно стабилна поради циклохексановия мост в дистанционното рамо. Това значително увеличава ADC стабилността на лекарството в циркулацията. Sulfo-SMCC се използва широко при синтеза на ADC, включително одобрения от FDA адастрастузумаб емтанзин.

След това тествахме две установени ASO. Никотинамид N-метилтрансферазата (NNMT) е модулатор на хистоновото метилиране, който регулира клетъчните енергийни разходи в мастната тъкан 16, 17. Лечението с NNMT-ASO предотвратява затлъстяването, предизвикано от диета 16. Одобреното от FDA лекарство Mipomersen е ASO срещу аполипопротеин В (ApoB) за лечение на известна хиперхолестеролемия 5. Използвайки концепцията за дизайн на ADC, ние синтезирахме нови съединения чрез химично конюгиране на NNMT-ASO и ApoB-ASO с Т3 хормон, използвайки сулфо-SMCC линкер. След това изследвахме ефектите на ASO-T3 биоконюгатите върху затлъстяването.

резултатът

Синтез и функция на ASO-T3

Тиреоидният хормон Т3 реагира първо със сулфо-SMCC, за да образува Т3, активиран с малеимид. След това продуктът се конюгира с фосфоротиоат, модифициран с NNMT-ASO или ApoB-ASO (фиг. 1а). Продуктите NNMT-ASO-T3 (NAT3) и ApoB-ASO-T3 (AAT3) не показват откриваеми свободни T3 или T3-SMCC (Допълнителна фигура 1a-d). Успешното конюгиране на ASO и T3 беше проверено чрез MALDI-TOF MS (Допълнителна фигура 2а, b). След това изследвахме дали конюгатите ASO-T3 могат да запазят функционалността ASO и T3. Репортерът активира рецепторите на щитовидната жлеза NAT3 и AAT3 (фиг. 1б, в). Ефектите са отслабени чрез лечение с хлорохин, инхибитор на подкисляването на лизозомите, което предполага, че лизозомата играе важна роля в активността на T3 NAT3 и AAT3 (Фиг. 1b, c). Изглежда, че активността на ASO в конюгатите на ASO-T3 зависи от целта. AAT3 намалява експресията на ApoB до подобна степен като ApoB-ASO (AA) в култивирани хепатоцити (фиг. 1г), докато NAT3 не успява да потисне експресията на NNMT в култивирани хепатоцити, адипоцити (не е показано) или мастна тъкан (фиг. 1д). Тъй като NAT3 няма NNMT-ASO активност и е известно, че ApoB-ASO няма ефект върху телесното тегло при животни и хора 18, 19, ние се фокусирахме върху изучаването на ефектите на AAT3 и NAT3 върху разхода на енергия и загубата на тегло.

научни

Ефекти на ASO-T3 върху генната експресия в метаболитните органи. ( а, б ) Браунинг маркери (Ucp1, Pgcla, Cidea, Cox7a1 и Cox8b) в ингвинална бяла мастна тъкан (iWAT). ( ° С ) Експресия на Ucp1 в епидидимална бяла мастна тъкан (eWAT). ( д ) Експресия на семейство от 6 носители на 6 разтворени вещества (Scl6a8), глицин амидинотрансфераза (Gamt) и митохондрии на креатин киназа 2 (Ckmt2) в eWAT. ( д ) Експресия на генни маркери на кафява мастна тъкан (BAT). ( е ) Чернодробна експресия на тироидния хормон (Dio1) и холестерол 7алфа-хидроксилаза (Cyp7a1) реагиращ на деодиназа-1 ген. ( ж ) Глюконеогенни гени (G6pase, Pepck) и гени за синтез на мастни киселини (Acc1, Acc2 и Fas) в черния дроб. ( з, i ) Mhc-b израз ( з ) и Mhc-a и тропонин (Trop) ( i ) в сърцето. ( j ) Експресия на Serca1 и Searca2a в мускулите. NAT3: NNMT-ASO-T3; AAT3: ApoB-ASO-T3. п = 4-6 на група; * p § p = 0,07 спрямо контрола, # p

Ефекти на ApoB-ASO-T3 (AAT3) върху нивата на LDL. ( а ) Чернодробни аполипопротеини B (ApoB) нива на иРНК. б ) Серумни нива на LDL. AA: ApoB-ASO. п = 5-6 на група; * p # p 25. Много лекарства, като тиреоидни хормони и агонисти на адренергичните рецептори, са доста мощни за увеличаване на енергийните разходи 26, 27, 28. Системните ефекти на тези лекарства обаче забраняват използването им при лечение на затлъстяване. Ситуацията е подобна на цитотоксичното лекарство за лечение на рак. Въпреки че цитотоксичните лекарства са ефективни при унищожаването на раковите клетки, те също така значително увреждат нормалните тъкани. Изкуството на ADC лекарствения дизайн носи терапевтична революция в лечението на рака, позволявайки целенасочено доставяне на цитотоксични лекарства към раковите клетки. Използвайки концепцията за дизайн на ADC и възползвайки се от насочването на мазнини и черния дроб на ASO, ние успешно разработихме конюгатите ASO-T3. Напоследък се съобщава, че конюгацията на хибриден хормон глюкагон-Т3 селективно се насочва към мастната тъкан и черния дроб, което води до забележителна загуба на тегло и подобрен метаболитен синдром при затлъстели мишки 29. Следователно, нов лекарствен дизайн за индуциране на мастен и чернодробен хипертиреоидизъм може да доведе до нова посока в разработването на лекарства за лечение на затлъстяване и метаболитен синдром.

Идеалният резултат от дизайна на ASO-T3 е поддържането на активността на ASO и T3, така че ASO да може да съсирва целевия ген, а T3 да активира рецепторите на щитовидната жлеза в мазнините и черния дроб. Целта е да се постигнат синергични ефекти на ASO и T3 върху подобряването на глюкозния, липидния и енергийния метаболизъм. Конюгирането на малки молекули с ASO обаче може да повлияе на стабилността и активността на ASO 29, 30. За двата тествани конюгата ASO-T3, които тествахме, само ApoB-ASO-T3 запазва ASO активност, докато NNMT-ASO-T3 не може да нулира NNMT. Следователно внимателният подбор и тестване на ASO е важно за успешното конюгиране на ASO-T3.

Въпреки че и T3, и ASO-T3 увеличават енергийните разходи, само мишките, третирани с ASO-T3, показват намалено телесно тегло и затлъстяване. За разлика от загубата на тегло при хора с хипертиреоидизъм, еутиреоидните мишки, лекувани с Т3, не губят систематично, а наддават. Това до голяма степен се дължи на преките ефекти на Т3 върху хипоталамуса върху стимулирането на приема на храна и ефектите върху червата за увеличаване на абсорбцията на хранителни вещества при мишки 20, 21, 22. Въпреки двойното хранене, енергийните разходи и усвояването изглежда са балансирани при мишки, третирани с Т3. Обаче циркулиращият Т3 не се увеличава при третирани с ASO-T3 мишки. По този начин няма системен ефект на Т3, който да компенсира увеличения разход на енергия, водещ до загуба на тегло и намалено затлъстяване.

Едно важно съображение за използването на ASO като вектор за самонасочване на тъкани е, че подобни на антитяло ASO в ADC се интернализират в тъканни клетки чрез ендоцитоза in vivo 10, 11 (фиг. 4в). Физиологичният процес на ендоцитоза не уврежда целостта на клетъчната плазмена мембрана и следователно е по-малко токсичен. Вътреклетъчно ASO се разграждат директно в лизозоми или се хибридизират до РНК и се разграждат от нуклеази 10, 31, 32. Инхибирането на подкисляването на лизозома от хлорохин намалява, но не отменя напълно Т3 активността (фиг. Lb, в), което предполага, че и двата пътя могат да участват в дисоциацията на ASO и T3 в култивирани клетки.

В обобщение, използвайки принципа ADC, ние успешно проектирахме ASO-T3 конюгати и демонстрирахме, че ASO-T3 може да представлява нова стратегия за разработване на лекарства за лечение на затлъстяване. Важно е, че ApoB-ASO (Mipomersen) е одобрено от FDA лекарство с установени профили на безопасност за лечение на известна хиперхолестеролемия. Конюгатът ApoB-ASO-T3 може потенциално да се използва при пациенти с общо затлъстяване с хиперхолестеролемия.

Материали и методи

Синтез на ASO-T3

Модифициран от фосфоротиоат ASO 16, 19 (мишка NNMT-ASO: 5-GAAATGAACCAGCAGGCCTT-3 и мишка ApoB-ASO: 5-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3) с 5'-тиол и C6 амино линкер са синтезирани от Bio-Synthesis (Lews) ). ). Тиреоидният хормон Т3 реагира първо със сулфо-SMCC, за да образува Т3, активиран с малеимид. След пречистване чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза (RP-HPLC), излишъкът Т3-SMCC реагира с тиол-функционализирани олигонуклеотиди, за да образува конюгати ASO-T3. Конюгатите се пречистват чрез RP-HPLC и се характеризират с MALDI-TOF MS.

Активност на рецепторите на щитовидния хормон

Клетките HEK293T се поддържат в модифицираната среда на Dulbecco на Eagle, допълнена с L-глутамин, 10% безастероиден хормон на фетален телешки серум, пеницилин и стрептомицин. Преходни трансфекции се извършват в 6-ямкови плаки с субконфлуентни клетки. Бяха извършени двустепенни трансфекции, тъй като не може да се измери луциферазна активност, когато плазмидите са котрансфектирани с ASO (не е показано). Плазмидите, включващи рецептор на тиреоиден хормон алфа (100 ng), бета рецептор на щитовидната жлеза (100 ng), рецептор на тиреоиден хормон DR4-луцифераза (100 ng) и PRL-TK (10 ng) бяха трансфектирани за първи път в клетки HEK293T с помощта на реагент за трансфекция FuGENE. HD (Рош) 40. Дванадесет часа по-късно клетките бяха трансфектирани с ASO-T3 (1 μM). Активността на луциферазата е измерена 36 часа след трансфекцията на ASO-T3. DR4-управляваната от луцифераза индуцирана активност на луциферазата се нормализира до PRL-TK-управлявана активност на Renla луцифераза. Хлорохин (100 μM) се добавя за инхибиране на подкисляването на лизозома 6 часа преди измерване на активността на луциферазата. Т3 (1 пМ) се добавя 24 часа преди събирането на клетки за положителни контроли на активността на репортер на хормона на щитовидната жлеза.

Лечение на ASO-T3 при мишки

Мишки от див тип C57BL/6 бяха закупени от лабораторията Jackson и поставени в 12-часов цикъл светлина/тъмнина (светлини в 7:00 до 19:00). Мишките първо бяха лекувани с диета с високо съдържание на мазнини (Research Diets D12331, 5, 56 kcal/gm) в продължение на 12 седмици. Проведена е ЯМР за изходен телесен състав. След това мишките бяха третирани с PBS контрол, T3 (200 μg/kg) или ASO-T3 (25 mg/kg) два пъти седмично. Проучванията за метаболитни клетки започват от 7-ми ден, когато няма разлика в телесното тегло. Повторната ЯМР е извършена три седмици след лечението. Проучванията на мишките са извършени в съответствие с федералните насоки и са одобрени от Институционалния комитет по грижата и използването на животните към Калифорнийския университет в Ървайн и Университета на Източна Каролина.

Измервания на серум Т3

Серумът Т3 се измерва чрез течна хроматография-тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS) 41, 42. Осемдесет микролитра серум от мишки, третирани с T3 или ASO-T3 в продължение на два часа, се смесват с аскорбинова киселина, лимонена киселина и дитиотреитол (25 μg/μl), за да се предотврати потенциалното превръщане на хормони на щитовидната жлеза. След едночасово инкубиране върху лед се добавят 640 μl урея и разтворът се инкубира за един час при 50 ° С. Пробите след това се подлагат на екстракция в твърда фаза преди инжектиране в LC-MS/MS. Разделянето беше постигнато с използване на GP-фенил (3 μm, 2.1 x 100 mm). Подвижната фаза на градиента се състои от 0,1% мравчена киселина във вода (А) и ацетонитрил (В) и скоростта на потока се регулира на 0,2 ml/min. Детекцията на масова спектрометрия се извършва на тристепенен тристепенен масспектрометър TSQ Vantage, напрежение на разпръскване: 3,2 KV, температура на изпарителя: 200 ° C, налягане на газа в кожуха: 45 arb, налягане на газа Aux: 15 arb, температура на капилярите: 270 ° В. Количественото определяне беше извършено чрез проследяване на избрани реакции (SRM) в режим на положителна йонизация и параметрите са m/z 651, 517 → 508.000 за T3 (CE 22 eV; S-обектив при 161 V), 461, 095 → 285, 056 за IS (CE 19 eV, S-обектив при 88 V).

Телосложение

Съставът на тялото се анализира при мишки, третирани с контролен PBS, T3, NNMT-ASO-T3 или ApoB-ASO-T3 в продължение на 3 седмици, като се използва инструмент EchoMRI 3-в-1 (Echo Medical Systems, Houston, TX).

Метаболитни клетки

Разходите за енергия бяха оценени с помощта на системата TSE PhenoMaster. Хранени с HFD мишки бяха третирани с контролен PBS, T3, NNMT-ASO-T3 или ApoB-ASO-T3 в продължение на 7 дни. Мишките се аклиматизират в метаболитни клетки 2 дни преди експериментите. Производството на CO2 и консумацията на O2 се събират на всеки 60 минути за всяка мишка в продължение на 3 до 4 дни. Нивата бяха нормализирани до чиста маса. Приемът на храна и активността се измерват на редовни интервали.

Измервания на серумна глюкоза, инсулин и LDL

Нивата на глюкоза са измерени с помощта на глюкозен колориметричен анализ (Cayman Chemicals). Инсулинът се измерва с ултрачувствителен инсулин ELISA комплект (Crystal Chem). LDL се измерва с помощта на комплекта за LDL анализ от BioAssay Systems.

Екстракция на РНК и количествена PCR

Мастната тъкан и РНК от черния дроб бяха извлечени с помощта на RNeasy Mini Kit (Qiagen). РНК от сърцето и мускулите се извлича с помощта на RNeasy Fibrous Tissue Mini kit (Qiagen). Hepa1-6 миши хепатомни клетки бяха трансфектирани с ASO и ASO-T3. РНК се екстрахира 48 часа след трансфекцията. PCR в реално време за SYBR се извършват, както е описано по-горе 43. Грундовете са изброени в Допълнителна таблица-1.

Статистически тест

Всички данни са изразени като средно ± sem Анализи на разсейване са извършени, последвани от posthoc тестове на Bonferroni-Holm за множество сравнения. Статистическа значимост за п