мониторинг

  • абстрактно
  • Основното
  • МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
  • Участници в проучването
  • Кръвни проби
  • Анализ на плазмените аминокиселини с използване на AAA
  • Анализ на аминокиселини от изсушени кръвни петна чрез HPLC с флуорометрично откриване
  • Анализ на аминокиселини от изсъхнали кръвни петна чрез тандем MS/MS
  • Диетичен рейтинг
  • Статистически анализ
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • ДИСКУСИЯ

абстрактно

Цел: Мониторингът на фенилаланин в кръвта е от решаващо значение за лечението на фенилкетонурия. Сравнихме три метода за измерване на концентрацията на фенилаланин в кръвта: анализатор на аминокиселини, високоефективна течна хроматография с флуорометрично детектиране и тандемна мас спектрометрия.

Методи: Проучихме 22 пациенти с фенилкетонурия на възраст 12-48 години, които участваха в нашия метаболитен лагер. Кръвта се събира в хепаринизирани епруветки (за анализ с помощта на аминокиселинен анализатор) или върху филтърна хартия (за анализ чрез високоефективна течна хроматография с флуорометрична детекция и тандемна мас спектрометрия).

Резултати: Плазмената концентрация на фенилаланин в кръвта, измерена от анализатора на аминокиселини, е значително по-висока от концентрацията, получена от пълна кръв върху филтърна хартия чрез високоефективна течна хроматография (разлика: 102 μM; 95% доверителен интервал: 23, 181) и тандем масова спектрометрия (разлика: 137 μM 95% доверителен интервал: 58, 216). Концентрациите на фенилаланин от високоефективна течна хроматография и тандемна масспектрометрия не се различават значително (P = 0,5).

Заключения: Когато проследяват нивата на фенилаланин в кръвта за спазване на храните, лекарите трябва да са наясно с използвания метод; анализите на пълна кръв върху филтърна хартия са били приблизително с 15% по-ниски от плазмените анализи.

Основното

Фенилкетонурията (PKU) е вроден метаболитен дефект, който е резултат от рецесивна генетична мутация, обикновено в гена, кодиращ фенилаланин хидроксилаза, ензима, отговорен за хидроксилирането на аминокиселината фенилаланин (Phe) до тирозин (Tyr), важен междинен продукт при производството на невротрансмитери. Ако не се лекуват, PKU метаболитите на Phe се натрупват и невротрансмитерите намаляват, което води до умствена изостаналост, поведенчески разстройства и гърчове. Този отрицателен ефект обаче може успешно да бъде предотвратен чрез диетично лечение, ако се започне през първите няколко дни от живота, така че всички държави вече включват PKU в своите скринингови панели за новородени.

Въпреки че няма универсални насоки, общоприетия подход за лечение на ФКУ е строга диета, която съдържа количеството непокътнат протеин, необходимо за поддържане на концентрациите на Phe в кръвта в обхвата на лечението и допълнена с метаболитна формула без Phe (т.е. медицинска диета). ), така че концентрациите на Phe в кръвта да не надвишават 360 μM (6 mg/dl; за превръщане на μM в mg/dl, разделено на 60) на възраст поне 6 години. 1 По-ниските концентрации на Phe са свързани с нормалните когнитивни способности при юноши и възрастни, което предполага, че могат да се получат оптимални резултати, когато нивата на Phe се поддържат на 120-360 μM за 12 години и 120-900 μM. 2 Строгият контрол на нивата на Phe в кръвта също е критичен по време на бременност; бебе, родено от майка, чиято ФКУ не е под метаболитен контрол, може да страда от умствена изостаналост, микроцефалия и вродена сърдечна недостатъчност. 3

Стремежът към хранителни навици през целия живот означава критична нужда от прости, бързи и точни методи за проследяване на нивата на Phe в кръвта. Един прост скрининг метод за новородени PKU, тестът за бактериална инхибиция Guthrie4, се използва повече от четири десетилетия. Оттогава са разработени няколко нови метода, включително аминокиселинен анализатор (AAA), флуорометрия, 5 високоефективна течна хроматография (HPLC), 6, 7 и тандемна мас спектрометрия (MS/MS). 8, 9 Тези нови техники се оказаха жизненоважни за подобряване на точността и скоростта, с които може да се извърши неонатален скрининг, 10, 11, но малко изследвания са изследвали валидността на тези методи за количествен анализ на абсолютните концентрации на Phe в кръвта, необходими за наблюдавайте пациентите.

Пациентите с PKU се различават по отношение на количеството активен ензим, вкусовите предпочитания на лечебните храни и желанието им да спазват предписана диета. Всички тези фактори правят лечението силно индивидуализирано и наблюдението е критично. В Отдела по медицинска генетика на Университета на Емори, ние рутинно се срещаме с пациенти с ПКУ в метаболитни клиники и годишен летен лагер, където кръвта се събира и анализира с помощта на ААА. Между тези посещения пациентите вземат пръстови отпечатъци у дома, прилагат кръв върху филтърна хартия и изпращат пробата в нашата клиника, където тя се анализира от HPLC или по-късно от MS/MS. Тъй като на същия пациент е вероятно кръвта му да бъде анализирана чрез AAA и HPLC, или MS/MS, или вероятно и от трите метода, използвани в момента в нашите лаборатории, ние се интересувахме от сравнението на концентрациите на Phe в кръвта, получени от тези три метода. По този начин, нашата цел беше да анализираме как трите метода (AAA плазма и HPLC и MS/MS на цели кръвни филтри) се сравняват за проследяване на концентрациите на Phe в кръвта.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Участници в проучването

Метаболитният лагер за момичета в университета Емори е създаден през 1994 г., за да отговори на нуждите на подрастващите, които трябва да се справят с поддържането на ограничителна диета и необходимата концентрация на Phe в кръвта им. Най-важното беше да се насочи към 12 юноши, поради потенциално вредните ефекти на лошия метаболитен контрол върху тяхното потомство; нашите по-нови лагери се разшириха, за да включват жени от всички възрасти. Кемперите прекарват една седмица в къщата в кампуса с изследователи и диетолози по метаболизма, които служат като „консултанти за къмпинг“. Дейностите в лагерите включват PKU и диетично обучение, уроци по готвене, приготвяне на медицински ястия, вземане на проби от нови добавки и социални пътувания. Данни за този анализ са получени от участници в седмичния лагер 2004: 25 момичета и жени на възраст 12-48 години.

Кръвни проби

По време на първата и последната сутрин на лагера участниците посетиха Общо-клиничния изследователски център на университета Емори (GCRC), където бяха измерени височината и теглото им. Кръвта се събира (2-3 ml) в хепаринизирана епруветка за анализ чрез AAA и директно върху филтърна хартия от епруветки за вземане на кръв за анализ чрез HPLC с флуорометрично откриване, пръчка MS/MS. Родители (ако лагерникът е бил на възраст под 18 години) или къмпингуващи са дали информирано съгласие преди началото на лагера и цялото събиране на данни е одобрено от Институционалния съвет за преглед на университета Емори.

Анализ на плазмените аминокиселини с използване на AAA

За анализ на аминокиселини използвахме AAA Beckman 6300 AAA, оборудван с вграден колориметричен детектор, както е описано по-рано 13 с незначителни модификации. Плазмените проби бяха депротеинизирани с равен обем 6% сулфосалицилова киселина и 400 μl супернатант се смесва с 500 μl литиев В буфер и 100 μl 0,25 mM S-аминоетилцистеин (SAEC) преди анализ. Пробата се инжектира върху високоефективна катионообменна колона на Beckman (10 x 0,4 cm) и свободните аминокиселини се разделят, като се използва комбинация от литиеви буфери A, D, E и F на Beckman Coulter (рН варира от 2,9 до 3,9) с програма с променлив йонообмен.сила и температура. След това аминокиселините бяха измерени колориметрично при 570 и 440 nm след дериватизация след колона с нинхидрин. Като калибратор се използва стандартна смес на Beckman. Софтуерът Beckman System Gold е използван за идентифициране и количествено определяне на аминокиселините, присъстващи в пробата, въз основа на техните съответни времена на задържане и стойности на абсорбция.

Анализ на аминокиселини от изсушени кръвни петна чрез HPLC с флуорометрично откриване

Анализ на аминокиселини от изсъхнали кръвни петна чрез тандем MS/MS

Кръг с диаметър 3 mm се избива от филтърна хартия, съдържаща кръвна проба, и се екстрахира със 100 μl метанол, съдържащ стабилни изотопно маркирани вътрешни аминокиселинни стандарти за 20 минути чрез обработка с ултразвук. След изпаряване на разтворителя аминокиселините се бутилират с 3 N бутанол НС1 в продължение на 15 минути при 65 ° С. След изпаряване до сухо пробите се разтварят отново в 100 μl подвижна фаза (80% ацетонитрил). За анализ MS/MS беше използван микро тандемен мас спектрометър Micromass Quattro със система Waters 2795 HPLC. Скоростта на потока LC се програмира с първоначален дебит от 0,15 ml/минута, 0,12 минути = 0,04 ml/минута, 1,1 минути = 0,6 ml/минута и 1,2 минути = 0,15 ml/минута, последвана от 0,8 минути равновесие с начална поток за следващата инжекция. Неутрална загуба 102 в режима на положителна електроспрей йонизация открива L-Phe и L-Tyr. Параметрите на мас спектрометъра бяха капилярно напрежение при 3,5 kV и напрежение на конуса при 35 V и енергията на сблъсъка беше 25 V. Сблъскващият газ беше аргон. Интензитетът на L-Phe и L-Tyr беше сравнен с техните стабилни изотопи, маркирани с вътрешни стандарти. За анализ на данните е използван софтуер NeoLynx.

Диетичен рейтинг

Кемперите попълваха 3-дневни записи за храна в продължение на 3 дни непосредствено преди първия ден на лагера, които след това анализирахме с помощта на софтуерната програма Ross AAA (версия 3.1, 1997, Ross Products Division, Columbus, OH).

Статистически анализ

SAS (версия 9.1, SAS Institute, Cary, NC) беше използван за всички статистически анализи. Изключихме трима къмпингуващи за непълни данни (те имаха полети рано сутринта и напуснаха сайта, преди да посетят GCRC за измерване и събиране на кръв), за да получим окончателен размер на пробата n = 22. За всеки от тези три метода всички проби бяха анализирани в дубликат и се използва. За да сравним тези три метода, изчислихме разликата в средните най-малки квадрати (PROC MIXED в SAS) и създадохме графики на разликата на Bland-Altman. 15 стр

Диаграма на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (анализатор на аминокиселини - високоефективна течна хроматография) в сравнение със средната концентрация на фенилаланин, определена от тези два метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътна линия и 95% с пунктирана линия.

Изображение в пълен размер

График на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (анализатор на аминокиселини - тандемна масспектрометрия) спрямо средната концентрация на фенилаланин, определена чрез тези два метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътна линия и 95% с пунктирана линия.

Изображение в пълен размер

Диаграма на Bland-Altman за процентната разлика в концентрацията на фенилаланин (високоефективна течна хроматография - тандемна масспектрометрия) спрямо средната концентрация на фенилаланин, определена чрез два метода. Средната процентна разлика се обозначава с плътна линия и 95% с пунктирана линия.

Изображение в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Открихме значителни разлики в концентрациите на Phe в кръвта, измерени чрез AAA, HPLC и MS/MS. Анализът на AAA в плазмата дава най-високи стойности на концентрацията на Phe в кръвта; HPLC и MS/MS, които използваха кръвни проби от филтърна хартия, не се различаваха статистически една от друга и концентрациите на Phe бяха постоянно с около 12% по-ниски за HPLC и 19% по-ниски за MS/MS в сравнение с AAA. Концентрациите на Phe в кръвта в кръвта, получени по тези три метода, са достатъчно различни, за да имат реално клинично въздействие, тъй като различните стойности вероятно ще доведат до значителни корекции в диетата или метаболитните храни от клинициста или диетолога, особено при по-високи концентрации на Phe.

В този анализ сравнихме три метода, използвайки кръвни проби (плазма или филтърна хартия), подготвени и анализирани, както се прави за проследяване на концентрациите на Phe в нашите лаборатории; сравнихме плазмените анализи с пълната кръв върху филтърна хартия за същия метод. Освен това, нашите кръвни проби от филтърната хартия бяха наблюдавани от проба от венозна кръв, взета от всяка каравана, а не от пръстов отпечатък; следователно тези проби не са напълно представителни за тези, които биха ни били изпратени за рутинно наблюдение. Решихме да използваме венозни проби само за да избегнем ненужния стрес на нашите кемпери от останалите чукове и да осигурим пълно и последователно насищане на филтърната хартия с кръв.

Нашият анализ беше подсилен от сравнително голяма извадка от момичета и жени с ПКУ, от които бяха взети кръвни проби на гладно и в два момента флеботоми бяха обучени директно върху филтърна хартия в Общия клиничен изследователски център. Нашите резултати подчертават необходимостта участниците в мониторинга на концентрациите на Phe да бъдат запознати с използваната методология като получени резултати. Необходими са допълнителни изследвания за сравняване на количественото определяне на плазмените концентрации на Phe спрямо пълната кръв върху филтърна хартия, използвайки тези различни методологии; По-доброто разбиране на разликите в аналитичните методи за мониторинг на Phe е от съществено значение за разработването на насоки за лекари и метаболитни диетолози, работещи с пациенти с PKU.