микробното

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Tempol предпазва мишките от затлъстяване и инсулинова резистентност
  • Tempol влияе върху чревните микробиотици и активността на BSH
  • Tempol увеличава чревните тауринови жлъчни киселини
  • T-P-MCA инхибира FXR сигналния път
  • Нарушаването на специфичния за червата FXR намалява затлъстяването
  • Tempol подобрява затлъстяването чрез инхибиране на чревния FXR
  • дискусия
  • методи
  • Химикали и реактиви
  • Проучвания върху животни
  • Подготовка и култивиране на първични хепатоцити
  • РНК анализ
  • Анализи на луцифераза
  • Метаболитни анализи
  • 16S rRNA генно секвениране на чревния микробиом
  • Анализ на метагеномни данни
  • Анализ на UPLC-ESI-QTOFMS
  • Обработка на данни и многомерен анализ на данни
  • BSH активност
  • Анализ на данни
  • Повече информация
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • Клетъчна сигнализация
  • микробиом
  • Затлъстяване
  • Терапевтични средства

абстрактно

Антиоксидантният темпол намалява затлъстяването при мишки. Тук демонстрираме, че темполът променя чревния микробиом чрез преференциално намаляване на рода Lactobacillus и неговата активност на хидролазата на жлъчната сол (BSH), което води до натрупване на чревна тауро-β-мурихолова киселина (T-P-MCA). T-P-MCA е ядрен рецепторен антагонист на фарнезоидния X рецептор (FXR), който участва в регулирането на метаболизма на жлъчната киселина, липидите и глюкозата. Повишените му нива по време на лечение с темпол инхибират FXR сигнализирането в червата. Fxr-нулеви мишки с високо съдържание на мазнини (Fxr AIE), хранени с диета с високо съдържание на мазнини, показват затлъстяване, предизвикано от диета, подобно на мишките от див тип, лекувани с темполо. Лечението с Tempol не намалява допълнително наддаването на тегло при мишки FxrAIE, което предполага, че чревният FXR медиира ефектите от затлъстяването на tempol върху затлъстяването. Тези проучвания показват биохимичната връзка между микробиома, сигнализирането на ядрените рецептори и метаболитните нарушения и предполагат, че инхибирането на чревния FXR може да бъде насочено от лекарства против затлъстяване.

Затлъстяването е достигнало глобални епидемични размери и е свързано с хронични заболявания като захарен диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания, хепатостеатоза и рак 1. Затлъстяването се развива в резултат на енергиен прием, превишаващ енергийните разходи, което води до нетно съхранение на излишни калории под формата на мазнини в мастната тъкан 2. Идеален фармацевтичен подход, който потиска апетита, блокира усвояването на мазнини в храната или насърчава мобилизирането на мазнини 3. Съобщава се, че Tempol (4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил), антиоксидант и радиационна защита 4,5, предотвратява затлъстяването при мишки 6. Неотдавнашно метаболомично проучване, базирано на масова спектрометрия, разкри, че темпол променя нивата на предполагаеми чревни микроби, генерирани от микроби, като предоставя първоначални индикации, че темпол може или да промени микробиомния състав, или да промени метаболитния потенциал на чревните бактерии 7. Интересното е, че tempol може също да инхибира вредните ефекти на исхемия/реперфузионно увреждане върху чревните тъкани на плъхове, като предотвратява бактериалната транслокация 8. Ефектът на темпол върху чревния микробиом обаче не е проучен.

Високопроизводителната 16S рибозомна РНК (16S rRNA) генно секвениране на чревни микробни популации и метаболомика на базата на масова спектрометрия са ефективни инструменти за характеризиране на чревния микробиом и метаболитите, съответно в биологичните матрици. 9, 10. Известно е, че нарушаването на чревния микробионен баланс в червата може да засегне различни метаболитни пътища in vivo, като метаболизма на мастни киселини и жлъчни киселини 11. Това може да допринесе за констатацията, че щамът Firmicutes и щамът Bacteroidetes, двете преобладаващи популации на микробиота както при мишките, така и при хората, са се променили при затлъстели мишки в сравнение със слаби животни 12. Смяташе се, че бракът 16S рРНК, секвенирането, метагеномиката и метаболомиката могат да хвърлят светлина върху взаимодействието между гостоприемника и 100 трилиона микроби, открити в червата 13. Към днешна дата обаче има ограничени проучвания, използващи тези високопроизводителни подходи за идентифициране на потенциални цели за лечение на затлъстяване и инсулинова резистентност.

В настоящото проучване е използвана комбинация от 16S rRNA генно секвениране и метаболомика, базирана на масова спектрометрия, за изследване на промените в чревния микробиом и метаболитите в модел на мишка с високо съдържание на мазнини (HFD), третиран с темпол. Освен това, специфични за червата мишки Fxr-Null (Fxr AIE) бяха използвани за изследване на механизма, чрез който чревният микробиом влияе върху затлъстяването и инсулиновата резистентност. Това проучване показва, че темпол намалява затлъстяването и инсулиновата резистентност чрез премоделиране на чревната микробиота, което води до промяна в състава на жлъчните киселини и свързано с това инхибиране на сигнализирането на фарнезоиден X рецептор (FXR).

резултатът

Tempol предпазва мишките от затлъстяване и инсулинова резистентност

Tempol влияе върху чревните микробиотици и активността на BSH

( а ) Типични криви на растеж на мишки, поддържани на HFD. n = 5 мишки на група. ( б ) съотношението тегло на мазнини към мазнини към постно тегло на мишки след 6 седмици HFD. n = 5 мишки на група. ° С ) GTT и площ под 7-седмичната HFD крива. n = 5 мишки на група. д ) ITT 13 седмици HFD. n = 5 мишки на група. д ) Глюкоза на гладно, инсулин на гладно и индекс на модела на хомеостаза за HFD за 14 седмици. n = 5 мишки на група. Всички данни са представени като средно ± sd, ANOVA, последвано от двустраничен t-тест на Student. * P fl/fl .

Изображение в пълен размер

Tempol подобрява затлъстяването чрез инхибиране на чревния FXR

а ) Криви на растеж на носители и темполо Fxr fl/Fl мишки и Fxr AIE мишки на HFD. n = 4-5 мишки на група. б ) Състав на тялото чрез NMR за показване на съотношението на мастната маса (вляво) и съотношението на мазнини към постно (вдясно) при мишки, третирани с превозно средство и темпола след 13 седмици HFD. n = 4-5 мишки на група. ( ° С ) GTT и площ под кривата след 5 седмици мишки, третирани с тамплиер на HFD. n = 4-5 мишки на група. д ) ITT след 6 седмици HFD. n = 4-5 мишки на група. д ) Глюкоза на гладно, инсулин на гладно и индекс за оценка на модела на хомеостазата след лечение с темпол на HFD в продължение на 16 седмици. n = 5 мишки на група. Всички данни са представени като средно ± sd, ANOVA, последвано от еднопосочен ANOVA с тест на Tukey. * Р 7. В модел на плъх с отлично запушване на мезентериална артерия, лечението с темпол предотвратява вредните ефекти от исхемия/реперфузионно увреждане върху чревните тъкани чрез намаляване на бактериалната транслокация 8. Тези резултати предоставят допълнителни доказателства, че темпол може да повлияе на микробиома.

FXR играе ключова роля в метаболизма на жлъчните киселини, липидите и глюкозата. Fxr -/- мишките са имали повишена хранителна непоносимост към глюкоза 33 и FXR агонистите подобряват инсулиновата чувствителност при генетичен модел на затлъстяване 34. Други проучвания обаче предполагат, че Fxr -/- мишките са подобрили хомеостазата на глюкозата и че FXR агонистите изострят нарушенията на липидния метаболизъм и инсулиновата резистентност при модели със затлъстели мишки 35, 36. Това противоречиво доказателство за ролята на FXR в патогенезата на метаболитните нарушения може да се дължи на FXR сигнализиране в черния дроб, за разлика от това проучване, което включва чревен FXR. В допълнение, разликите в чревната микробиота могат да обяснят горните експериментални резултати. Настоящото проучване предоставя доказателства в подкрепа на възгледа, че инхибирането на чревния FXR както в модела на генетична аблация на мишките Fxr AIE, така и при мишките, лекувани с темполи, подобрява затлъстяването, предизвикано от диетата и инсулиновата резистентност.

Въпреки че пълният механизъм, чрез който чревната FXR сигнализация влияе върху затлъстяването, не е напълно установен, липидомиката разкрива, че серумните C14, C18, C18: 1, C20: 4 SM и съотношението керамид към S1P при Fxr AIE и мишки, лекувани с темполи, са многобройни изследвания през последното десетилетие подкрепят ролята на МС и неговите метаболити в патогенезата на метаболитните нарушения, свързани със затлъстяването 22. SM може да се метаболизира до церамид, сфингозин и S1P 37. Ceramide активира протеин киназа C, c-jun N-терминална киназа и инхибира предаването на инсулиновия път на предаване в периферни инсулинови целеви тъкани, като черен дроб и мастна тъкан 38. Съобщава се, че S1P противодейства на ефектите на керамид. Доказано е, че повишеното съотношение на керамид към SIP допринася за инсулинова резистентност и затлъстяване 39. Дали това е основният начин да се медиират ефектите на tempol и FXR върху затлъстяването изисква допълнително проучване.

В обобщение, метагеномиката и метаболомиката показват, че инхибирането на чревната FXR сигнализация чрез лечение с темпол е свързано с намаляване на активността на Lactobacillus и неговата BSH активност. Натрупването на T-P-MCA в червата е придружено от FXR инхибиране. Неотдавнашно проучване, използващо мишки без бактерии, разкри, че T-P-MCA може да инхибира FXR сигнализирането in vivo в червата 21. Това подкрепя in vitro проучванията, докладвани тук. Констатацията, че tempol подобрява затлъстяването чрез инхибиране на чревната FXR сигнализация, предполага, че чревният FXR може да действа като потенциална клинична цел при лечението на затлъстяване.

методи

Химикали и реактиви

Храмът е закупен от Sigma (Сейнт Луис, Мисури). Жлъчните киселини са поръчани от Steraloid, Inc. (Newport, RI) и Sigma и TCA-d5 натрий бяха от Toronto Research Chemicals Inc. (Торонто, Онтарио). SM и керамиди са получени от Avanti Polar Lipids. Комплектът S1P ELISA е закупен от Echelon Biosciences Inc. (Солт Лейк Сити, Юта). Комплектът за жлъчна киселина е закупен от Catachem, Inc. (Оксфорд, CT). Всички разтворители и органични реактиви бяха от най-високия клас.

Проучвания върху животни

Подготовка и култивиране на първични хепатоцити

Хепатоцитите са получени по общия перфузионен метод 41. Първични хепатоцити от 6-седмични мишки C57BL/6N са получени чрез перфузия на колагеназа 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетките се пречистват чрез центрофугиране с плътност от 45% перкол (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) и се култивират в DMEM (Invitrogen) с 10% фетален говежди серум и 1% инсулин-трансферин-селен-етаноламин (Invitrogen). Жизнеспособността на хепатоцитите беше определена с помощта на изключване на трипан синьо багрило и бяха използвани тези с жизнеспособност над 85%. Средата беше променена на DMEM с 1% фетален говежди серум след култивиране в продължение на 4 часа. След гладуване в продължение на 4 часа, клетките бяха изложени на tempol/TCA/T-β-MCA/TCDCA/TUDCA/CDCA в продължение на 24 часа.

РНК анализ

Лигавицата на червата внимателно се остъргва и бързо замразява в течен азот и се съхранява при -80 ° С, докато се приготви РНК. РНК се екстрахира от замразено черво, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen). Допълнителна ДНК се синтезира от 1 μg обща РНК, като се използва Superscript II обратна транскриптаза (Invitrogen). qPCR праймерите са проектирани с qPrimerDepot и последователностите са показани в допълнителната таблица S1. qPCR се извършва с помощта на SYBR зелена PCR главна смес в система за откриване на последователност ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Измерените нива на иРНК бяха нормализирани до тези на 18S рибозомна РНК и изразени като кратна промяна спрямо тези на контролната група.

Анализи на луцифераза

Грейс Гуо (Университет Рутгерс) предостави конструкцията на луцифераза на светулка PGL4-Shp-TK и плазмид за експресия на човешки Fxr. Пол А. Доусън (Училище по медицина на Уейк Форест) предостави човешки плазмид за експресия на Asbt. Плазмидите бяха трансфектирани в Caco2 (ATCC HTB-37) клетки, използвайки X-tremeGENE HP ДНК трансфекционен реагент (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Клетките се лизират и активността на луциферазата се измерва с комплект за анализ на двойна луцифераза (Promega, Madison, WI). Активността на луциферазата на светулка се нормализира до активността на луциферазата на Renilla.

Метаболитни анализи

За GTT мишките са гладували в продължение на 16 часа, взема се кръв и мишките се инжектират интраперитонеално с 1 g kg -1 глюкоза. За ITT мишките бяха на гладно в продължение на 4 часа, взема се кръв и след това се инжектира интраперитонеално с инсулин (Eli Lilly, Washington, DC) 1 U kg -1 телесно тегло. Кръвни проби се вземат от опашката на 15, 30, 60 и 90 минути след инжектирането и глюкозата се измерва с помощта на глюкомер (Bayer, Pittsburgh, PA). Засиленият серумен инсулин се измерва с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен тест (Crystal Chem Inc., Downers Grove, IL).

16S rRNA генно секвениране на чревния микробиом

Бактериите в изпражненията и цекума се екстрахират с помощта на PowerSoil ДНК изолационен комплект (Mo Bio laboratorij, Inc., Карлсбад, Калифорния). PCR продуктите (

1,000 bp) бяха пречистени с помощта на технологията AgencourtAMPure (Beckman Coulter, Brea, CA), както е описано в 454 Технически бюлетин номер 2011-002, Процедура за отстраняване на къси фрагменти. След пречистване продуктите се определят количествено както от Qubit (Lifetech, Карлсбад, Калифорния), така и от qPCR, като се използва KAPA Biosystems Library Quantification Kit (KapaBiosystems, Woburn, MA). Продуктите се обединяват въз основа на моларни количества, пускат се върху 1% агарозен гел и се екстрахират. След почистване с QIAquick PCR пречистващ комплект (Qiagen, Валенсия, Калифорния), качеството и количеството бяха оценени с помощта на DNA 7500LabChip на биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния) и количествено определяне на Qubit. Последователността беше извършена с помощта на четвърт пикотитърна плоча на 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX + (Roche Diagnostics). qPCR беше извършен с помощта на SYBR зелена PCR главна смес в система за откриване на последователност ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). PCR условията са 50 ° С за 2 минути; 95 ° С за 10 минути; 40 цикъла от 95 ° C за 15S; и 60 ° С за 1 мин.

Анализ на метагеномни данни

Експерименталната настройка се състоеше от 14 проби, разпределени като 6 копия на превозно средство и 8 повторения на матрицата на темпол. След качествено филтриране и дедупликация, всяка проба съдържа средно 11 000 четения. Софтуерният пакет 42 на mothur беше използван за предварителна обработка на данните за секвениране и мултикласификатор 43 на Ribosomal Database Project за присвояване на всяка последователност на таксономичен ранг. Предварителната обработка се състоеше от филтриране на четения за средно качество от 20, премахване на дублирани последователности и разделяне на проби по баркодове, като същевременно се дава възможност за едно несъответствие в баркода. Персонализиран статистически инструмент, използващ дисперсионен анализ (ANOVA) с дизайн на факториално третиране, открива таксономични редици, които показват статистически значими промени между пробите. За да се отчетат разликите в общия брой четения на извадка, класификациите бяха преобразувани в процент от общия брой четения. Тогава този подход позволи точни сравнения в и между групите.

Въведен е ANOVA анализ с факториален дизайн на лечение, за да се открият бактерии, които значително са се променили в броя.

Пълният модел се нарича модел на фиксирани ефекти.

Лечения tempol и превозно средство

Проучване: проучване 1, проучване 2 (повторно секвениране на проучване 1)

Хипотеза: бактериите са непроменени при различни дози.

с i = 1, 2, 3; j = 1, 2; k = 1, 2, 3, 4

с i = 1, 2, 3; k = 1, 2, 3, 4

Пълният модел третира двете проучвания (проучване 1 и проучване 2) като блок, за да се види първо дали има ефект на „проучване“. Ако ефектът от „изследването“ е значителен, изследванията се пазят отделно в проблема като блоков ефект 42. Ако не, той се отстранява и комбинира с данни от две проучвания 43. И накрая, корекцията на Шидак беше използвана за корекция на P-стойност.

Анализ на UPLC-ESI-QTOFMS

Обработка на данни и многомерен анализ на данни

Необработените данни бяха подравнени с помощта на софтуера MarkerLynx (Waters Corp.), за да се генерира матрица от данни, състояща се от пикови области, съответстващи на уникален m/z и време на задържане без нормализиране. Анализът на метаболомиката, включващ анализ на основните компоненти и PLS-DA модели, беше извършен със SIMCA-P + 12 (Umetrics, Kinnelon, NJ) 44. Йоните с корелация 0,8 към модела значително допринесоха за разделянето между контролната група и групата, лекувана с темпол.

BSH активност

Фекалните протеини се приготвят от фекалната проба (0,5 g) в рН 7,4 PBS (5,0 ml), като се използва ултразвук 45. Активността на BSH беше измерена въз основа на генерирането на CDCA от TCDCA във фекалиите. Накратко, инкубацията беше проведена в 3 mM натриев ацетатен буфер, рН 5.2, съдържащ 0.1 mg ml -1 фекален протеин и 50 μM TCDCA-d5 в краен обем от 200 μl. След 20-минутна инкубация при 37 ° С, реакцията беше спряна чрез потапяне на пробите в сух лед. Сто микролитра метанол се добавят директно към реакционната смес от 100 μl. След центрофугиране при 14 000 × g в продължение на 20 минути, 5 μl от супернатантата се прехвърлят в флакон с автоматичен проби, подложен на анализ чрез UPLC система, съчетана с XEVO тройно квадруполен тандемен мас спектрометър (Waters Corp.).

Анализ на данни

Експерименталните стойности са представени като средни стойности ± sd, статистическият анализ е извършен, като се използва двустранен t-тест на Student и еднопосочен ANOVA съответно с тест на Tukey и тест на Dunnett. P стойности