микрохимеризъм

  • абстрактно
  • Основното
  • методи
  • Пациенти.
  • Събиране на тъкани.
  • Количествена RT-PCR.
  • Определяне на HLA.
  • РЕЗУЛТАТИТЕ
  • ДИСКУСИЯ
  • Терминологичен речник

абстрактно

По време на бременност малък брой клетки преминават между майката и плода и този трансфер може да доведе до химерно състояние, което се запазва с години и при двете индивиди. Както феталният, така и майчиният микроимимеризъм (MMc) са свързани с различни автоимунни нарушения. Информацията за MMc в тъканите на здрави индивиди е оскъдна, но е важна при търсенето на майчините клетки в засегнатите тъкани на определени заболявания. Целта на това проучване е да изследва появата на майчините клетки в сливиците и аденоидите на 20 здрави деца на възраст от 2 до 15 години. Всички деца са претърпели операция за повтаряща се ангина или обструкция на дихателните пътища. MMc е открит чрез RT-PCR въз основа на разликите в генните полиморфизми между майката и детето. Открихме майчини клетки в сливиците и/или аденоидите при четири от 20 деца. Тази честота е по-ниска от честотата на майчините клетки, открити в периферната кръв на здрави възрастни, но съответства на съобщената по-рано честота на майчински химеризъм в контролните тъкани.

Основното

Двупосочното преминаване на майчините и феталните клетки през плацентата може да доведе до химерно състояние, което се запазва с години в майката и нейното потомство (1, 2). Функцията и значението на тези полуалогенни клетки са неизвестни. Въпреки че последиците от феталния микрохимеризъм (малък брой фетални клетки при майката) не са известни, смята се, че феталните клетки участват в задействането на автоимунни нарушения (3-7) или действат като подмладяващ източник, участващ в процесите на възстановяване на тъканите. (8, 9). Други доклади сочат феталните химерни клетки като "невинни странични наблюдатели" при възпалителни или лечебни процеси (10).

Предаването на малък брой стволови клетки на потомството по време на бременност, майчиният микробимеризъм (MMc), е проучен в по-малка степен от феталния микрохимеризъм. Клетките на майката са открити при различни концентрации на кръв в плода от 13 седмица (11) и до 100% в проби от кръв от пъпна връв в зависимост от метода, използван за откриване на майчините клетки (12-14).

Наскоро съобщихме за откриване на майчини имунокомпетентни клетки в триместрални фетуси от 11 години (15), които са били прекъснати поради малформации и/или тризомия 21 или поради социални причини. Клетките на майката са открити в седем от 11-те плода и тези клетки експресират повърхностни маркери за Т- и В-лимфоцити, левкоцити и хематопоетични родословни клетки. Клетките на майката присъстват във всички изследвани органи и са открити при нормални плодове и при плодове с малформации и/или тризомия 21.

Освен това, Stevens et al. (16) наскоро показа, че майчините клетки присъстват в различни видове тъкани при седем бебета от мъжки пол. Те също така показаха, че майчините клетки са диференцирани в специфични типове клетъчни органи. Малоуни и др. (2) демонстрира, че майчините клетки присъстват в кръвта на здрави индивиди на средна възраст.

Както при феталния микрохимеризъм, потомствените майчини клетки са свързани с различни автоимунни заболявания, особено състояния, които се срещат при деца (17-25). Тъй като съдбата на тези полуалогенни стволови клетки е до голяма степен неизвестна, особено в тъканите на здрави индивиди, ние се опитахме да определим дали стволовите клетки присъстваха в лимфоидните тъкани на деца през детството в опит да изяснят потенциалната роля на MMc в имунната система развитие. В предишни проучвания ние демонстрирахме присъствие на зрели майчини Т и В клетки, както и хематопоетични предшественици в различни фетални тъкани. В това проучване изследвахме MMc в сливиците и аденоидната тъкан, които са естествено богати на лимфоидни клетки и дори могат да представляват потенциално място на постнаталната лимфопоеза (26).

методи

Пациенти.

Взети са проби от тъкани от сливици и/или аденоиди на 20 деца, подложени на тонзилектомия и/или аденоидектомия. От литературата и предишната ни работа се основаваме на 30% разпространение на MMc в различни тъкани. Затова предположихме, че 20 случая трябва да осигурят размер на пробата за тестване за наличие на майчини клетки в сливиците и аденоидните тъкани на потомството.

Показания за операция са дихателната обструкция (хъркане) и/или рецидивиращ тонзилит (Таблица 1). На майката на детето беше предоставен въпросник за здравословното състояние на майката и детето. Въпросите включват продължителността на периода на кърмене, майчината история на майката, дали майката или детето са преливали кръв и дали майката или детето са били близнаци. Характеристиките на децата и техните майки са изброени в таблица 1. Нито едно от децата или майките не е било близнак или някога е получавало кръвопреливане и всички участници са здрави, с изключение на една майка с хипотиреоидизъм и една с фибромиалгия. Историята на ражданията на децата е била нормална във всички случаи, с изключение на един случай, когато детето е било родено на 33-та седмица от бременността поради разкъсване на плацентата (случай 17).

Маса в пълен размер

Събиране на тъкани.

Периферна кръв се събира от майки и деца. При децата както сливиците, така и аденоидите бяха отстранени чрез кюретаж под обща анестезия и веднага след операцията бяха изпратени за дисекция и допълнителен анализ в патологичния отдел.

Тъканите се измиват със стерилен физиологичен разтвор и се нарязват при стерилни условия. Всеки бадем беше разделен на две половини. Парче тъкан с размери приблизително 5 х 5 х 5 мм е взето от всяка половина за PCR анализ. По този начин в анализа бяха включени общо четири фракции от всяка двойка бадеми (обозначени с Т1 до Т4). Тези фракции бяха събрани от централната област на сливиците, за да се предотврати замърсяване с епителни клетки и възможни възпалителни ексудати на повърхността на криптите. Аденоидът беше разделен по подобен начин на две половини и от всяка половина беше отстранено малко (средно) парче тъкан за PCR анализ. Не е извършено хистопатологично изследване на тъканите. Това проучване е одобрено от Комитета по етика на университетската болница в Каролина (Dnr 2008/3: 3). Одобрението на Институционалния съвет за преглед беше получено от всички пациенти.

Количествена RT-PCR.

ДНК от проби от кръв, бадем и аденоид се извлича с помощта на Qiagen Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Концентрацията на тъканна ДНК първоначално се разрежда до 100 ng/μl, за да се получат общо 500 ng във всяка PCR реакция.

Специфичността и чувствителността на метода RQ-PCR се определя за всички маркери, включени в това проучване, като се използват изкуствени смеси от ДНК и променливи количества ДНК. PCR анализът се потвърждава чрез смесване на ДНК от един индивид (положителен за три маркера) при различни концентрации в друг индивид (отрицателен за маркери). Общото количество ДНК е 500 ng, което се демонстрира чрез стабилна Ct стойност за GAPDH (данните не са показани). Използвайки 500 ng ДНК и 40 цикъла на PCR амплификация, не открихме фалшиво положителни резултати.

Определяне на HLA.

Полиморфизмите на HLA-A, -B и -DRB1 бяха определени с помощта на стандартни PCR-базирани методи (LabType, One Lambda, Inc, CA), включително специфични за последователността олигонуклеотидни сонди (PCR-SSOP), използвайки xMAP технология (Luminex System, Luminex Corporation, Остин)., Тексас).

РЕЗУЛТАТИТЕ

Клетките на майката са идентифицирани при четири от 20 деца (Таблица 2). Децата, които са били положителни за MMc в сливиците и/или аденоидите, са две момчета (случаи 9 и 15) и две момичета (случаи 10 и 14) на възраст от 4 до 6 години. Случаи 9 и 14 са положителни при всички тъканни фракции, както и в изследваната кръв. Случай 10 е положителен за стволови клетки във всички тествани фракции, с изключение на една от сливиците (Т4) и две аденоидни фракции. Случай 15 е положителен само в една от четирите бадемови и кръвни фракции. Установено е също, че всички MMc-положителни случаи в кръвта са положителни в сливиците или аденоидните тъкани с приблизително подобна скорост. Подробни RT-PCR данни за MMc проби са показани в Таблица 3. Не е открита очевидна връзка между наличието на майчини клетки в сливиците и/или аденоиди и различни комбинации от HLA класове по майчина и педиатрична възраст (данните не са показани).

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

ДИСКУСИЯ

Това проучване потвърждава предишни доклади, че MMc е относително често явление. Повечето проучвания оценяват честотата на MMc при пациенти с различни заболявания, въпреки че е съобщена ограничена информация за MMc при здрави индивиди, особено в тъканите. През втория триместър, фетуси от социално мотивирани окончания, успяхме да извършим MMc в различни органи в около 50% от случаите от 13-та седмица на бременността (15). Плесен и др. (29) съобщават дори по-високи стойности на MMc във фетални лимфни възли, получени от аборти през втория триместър. До 100% от всички бебета при раждане имат майчини клетки в кръвта от пъпната връв (12–14) и очакваната честота на майчините клетки е между 0,02 и 5% (9, 11, 12). Данните за MMc след раждането се базират предимно на кръвни проби. MMc може да продължи до средна възраст и в зависимост от метода, използван за откриване, стойностите на MMc варират от 20 до 39% в различни клетъчни популации в периферната кръв (30). По този начин MMc изглежда често срещан и продължава много години.

Информацията за броя и разпределението на майчините химерни клетки в органите и тъканите на здрави индивиди може да бъде от решаващо значение за разбирането на потенциалната физиологична роля на тези клетки; много малко изследвания обаче са разгледали този въпрос. Резултатите от тези доклади са обобщени в Таблица 4. При изследвания за аборти, биопсия и аутопсия, MMc е открит в различни тъкани, като кожа, сърце, черен дроб, далак, тимус, щитовидна жлеза и панкреас. (15–25, 29, 30, 31) и нито един специфичен орган няма видимо предразположение към MMc. Тези отчети се различават значително по отношение на честотата на MMc и честотата на цитиране от 0 до 100%, въпреки че валидността на публикуваните резултати е била повлияна от няколко ограничения. В много случаи материалът на пациента беше ограничен по размер и методите за откриване бяха много различни. В допълнение, повечето от контролите, използвани в проучванията, са пациенти със сериозно заболяване в определен орган (т.е. кожа, мускули, черен дроб и др.), А не здрави индивиди.

Маса в пълен размер

Това проучване е първият доклад за MMc в сливиците и аденоидната тъкан. Нашето изследване на тези тъкани се основава отчасти на факта, че успяхме да изследваме майчините клетки в лимфоидни органи, които са лесно достъпни в тъканите на относително здрави деца. Бадемите и аденоидните тъкани се развиват след раждането и представляват първата линия на защита срещу микробна инвазия в горната аеро-храносмилателна система. Имунологичните процеси, свързани с В и Т лимфоцитите, се инициират в различни специализирани отделения на небните сливици (32, 33). Аденоидът също е активен имунологичен сайт в назофарингеалната област, който носи клетки както от вродената, така и от адаптивната имунна система (34, 35).

Тук анализирахме прясна тъкан с фокус върху несподелените полиморфни области на майката в извлечената ДНК. Имаше няколко ограничения за нашето проучване. Въпреки че открихме MMc в 20% от случаите, броят на пациентите, включени в проучването, беше ограничен. Освен това, в съгласие с Alizadeh et al. (27), чувствителността на метода на RQ-PCR химеризъм е 0,01% за повечето маркери. Под 0,1% линейността на метода се нарушава, но чувствителността все още може да бъде до 0,01%. Нивото на майчински химеризъм варира при отделните индивиди и въпреки че този метод е много чувствителен, още по-чувствителен метод може да доведе до повече положителни случаи.

По този начин на теория този метод може да подцени MMc. Освен това, тъй като не извършихме никакъв in situ анализ, не можахме да оценим анатомичното местоположение и интеграцията на тези клетки. Следователно не можем да твърдим, че майчините клетки са интегрирани в тъканта на сливиците или че тези клетки циркулират в малките съдове, свързани с криптите на сливиците. Тези проблеми изискват допълнителни проучвания, съчетаващи имунохистохимия с други техники за идентификация на майчините клетки, като хибридизация in situ за X и Y хромозоми. По същия начин, въпреки че нашите данни предполагат добра корелация между MMc в кръвта и тонзиларната тъкан, проблемът не е разрешен, тъй като ние го направихме не предоставят доказателства за трансплантация на химерни клетки на майката.

Остават въпроси защо MMc продължава при някои индивиди, въпреки разликите в HLA между майката и детето. Механизмът, по който плодът разпознава и толерира майчините клетки, е неизвестен, но е вероятно поглъщането на майчините клетки да е функция на незрялата имунна система на нероденото дете. В това проучване не успяхме да покажем каквато и да е очевидна връзка между HLA майките и децата и наличието на MMc; Сравнително ограниченият материал в нашето проучване обаче не даде окончателен отговор дали HLA съвместимостта между майката и детето може да повлияе на външния вид (или вида) на MMc.

Друго съображение при спекулациите относно функцията на майчините клетки е дали тези клетки са в състояние да демонстрират клетъчна пластичност. Stevens et al. (19) В проучвания на MMc на миокарда при деца със синдром на новородения лупус е показано, че майчините клетки се диференцират в сърдечни миоцити. В предишните си проучвания ние показахме, че CD 34+ и CD 45+ клетки могат да се предават през плацентата от майката на плода. И двата типа клетки могат да проявяват пластични свойства (41).

Друг аспект на спекулациите относно функцията на майчините клетки е дали тези клетки са в състояние да демонстрират клетъчна пластичност. В предишните си проучвания ние показахме, че CD 34+ и CD 45+ клетки могат да се предават през плацентата от майката на плода. Тези клетки експресират клетъчен маркер за хемопоетични и ендотелни клетъчни предшественици. Stevens et al. (19) изследва подобни клетъчни маркери в сърдечната тъкан на деца с неонатален лупус и вроден сърдечен блок и показва, че 86% от майчините клетки, открити в миокарда, също експресират саркомерен α-актин, специфичен маркер на кардиомиоцитите. По този начин майчините клетки в потомствените тъкани изглежда показват пластичност. Тази естествена пластичност може да играе важна роля за въздействие върху майката и нейното потомство. Този механизъм може също да обясни как придобитите способности, полезни и/или вредни за едно дете, могат да се предават от едно поколение на друго като епигенетичен ефект.

В заключение, MMc е открит в 20% от пробите на сливиците и аденоидната тъкан от здрави деца на възраст от 2 до 15 години. Доколкото ни е известно, това изследване е първото, което изследва MMc в тези тъкани. Тъй като тези органи играят централна роля в имунната регулация на развиващото се дете, са необходими допълнителни проучвания за изследване на биологичните ефекти на MMc в тези тъкани.