елементи
абстрактно
В продължение на много години се смяташе, че археите са или метаноген, или екстремофил. Въпреки това, през последните няколко десетилетия, субединицата на малката рибозомна РНК (rRNA) и генният анализ на 16S rRNA на проби от околната среда разкриха присъствието на археи в аеробна морска среда при умерени температури (DeLong, 1992; Fuhrman et al., 1992). Тези археи (принадлежащи предимно към поддомейн Crenarchaeota) са открити в почви (Birtrim et al., 1997), полярни морета (Murray et al., 1998), устия (Abreu et al., 2001), пещери (Gonzalez et al. ., 2006), широк спектър от океански среди (DeLong et al., 1994; Stein and Simon, 1996; Massana et al., 1997; Massana et al., 2000; Karner et al., 2001), дълбоководни утайки (Vetriani et al. al., 1999; Teske et al., 2002; Søresnson and Teske, 2006; Biddle et al., 2008) и солни блата (Nelson et al., 2009). Въпреки че кренархеотите са широко разпространени в световен мащаб и често се срещат в различни среди, сравнително малко се знае за техните метаболитни способности.
В този доклад са представени SIP експерименти, които показват 13C-включване на различни органични субстрати от членове на Various Crenarchaeota Group (Inagaki et al., 2003) и Marine Group I (Vetriani et al., 2003). Нашите резултати показват, че солната блатна кренархеота е способна да асимилира широк спектър от органични въглеродни субстрати, които също се използват от бактериални популации in situ, което предполага конкуренция между двата домена. Освен това има данни за разпределение на ресурсите за урея и цели протеини. Интересното е, че е необходима минимална инкубация от 5 дни, за да се получи ясен SIP сигнал за кренархеи, което показва относително дълго (2-2, 5 дни) удвояване на времето в сравнение с бактериалната общност. Тези открития предполагат, че механизмите отгоре надолу и отдолу нагоре позволяват стабилно съжителство на кренарии и бактерии в условия на солен блат.
Материали и методи
Агарозен гел от 16 С рРНК генни ампликони от 13 С-ивици: а1) празен; а2) ламбда ДНК; а3) отрицателен; а4) носител; а5) няма субстрат; а6) 13 С-липид (2 mg ml-1); а7) 13 С-липид (10 mg ml-1); а8) 13 С-протеин (2 mg ml-1); а9) 13 С-протеин (10 mg ml-1); а10) 13 C-ISOGRO (2 mg ml-1); a11) 13 C-ISOGRO (10 mg ml-1); а12) положителен контрол; b1) ламбда ДНК; b2) отрицателен; b3) 13 С-носител; b4) T0 (време = 0; проба, взета преди лечението); b5) няма субстрат; b6) 12С-урея; b7) 13 С-урея; b8) 12С-бикарбонат; b9) 13 С-бикарбонат; b10) празен; b11) тест за инхибиране (положителен плюс проба); b12) положителен контрол.
Изображение в пълен размер
Маса в пълен размер
Включването на бактерии от 13 С също може да бъде открито при експерименти с SIP. Синтез на бактериална 13 С-ДНК се наблюдава в 83% от микрокосмоса, с изключение на ниските концентрации на урея и ISOGRO (Таблица 2). Сравнително дългото SIP време за инкубация (5 дни) най-вероятно позволява обширни кръстосани бактерии (Gallagher et al., 2005) и 13 C-CO 2 поколение (данните не са показани). Инкубация с 13 С-бикарбонат също беше извършена, за да се провери дали кренархеите действително поемат 13 СО2 вместо 13 С-маркирани субстрати по време на нашия SIP експеримент. Резултатите са показани на Фигура 1b. Лечението с 13 С-бикарбонат не дава никакъв кренархеален ампликон в 13 С-лентата (път 1b-9). Анализът за PCR инхибитори чрез увеличаване на положителната ДНК проба на 13C-DNA от инкубация с бикарбонат не показва никакво PCR потискане от този екстракт (път 1b-11). Тези резултати показват, че SIP кранархеалният сигнал е резултат от включването на 13C-органични вещества, а не на 13C-белязан бикарбонат, който се получава чрез бактериално дишане.
Маса в пълен размер
Пример за TRFLP профили на кренархеални 16S рРНК гени в 12 С- и 13 С-ленти от липидна промяна. Осветените върхове (сиви) са показани в клоналната библиотека.
Изображение в пълен размер
Компилация на пръстови отпечатъци на Cernarchaeal с TRF от 85 до 169 bp ( а ) и 170-254 bp ( б ). Големите пикови размери са обозначени с квадратчета (фиксирани, открити в клониращата библиотека; прекъснати, неоткрити). Светлите нюанси показват по-високи концентрации; тъмните нюанси показват по-ниски концентрации.
Изображение в пълен размер
Определя се филогенетичната оценка, използваща дървото на максималната вероятност (PhyML) с поддръжка от 100 стартови ленти. Клоновете в това проучване са обозначени с номера за присъединяване на TRF и GenBank. Черните точки представляват последователности, открити в крайбрежни или устни утайки. Отворените точки показват последователности от дълбоководната биосфера.
Изображение в пълен размер
дискусия
В този доклад SIP микрокосмосите се приготвят с помощта на филтрирана стерилизирана вода и инкубацията се прекратява след 5 дни. Установено е, че солено блато със солено блато със сирене е хетеротрофно, без абсорбция на 13С от бикарбонат по време на експеримента. Някои кренархеални TRFs бяха открити в 13-С фракцията от почти всеки микрокосмос, допълнен с органичен 13 С-въглерод, независимо от вида на предоставения субстрат. Това предполага, че тези специфични кренарии са способни да асимилират широк спектър от органични субстрати: межди метаболитни междинни продукти (ацетат), аминокиселини (глицин), органични азотни съединения (урея), липиди и пигменти и сложни смеси от биополимери (ISOGRO). Обаче други кренархеални TRR са открити само в 13 С-ивици от субстратно-променени микрокози (ацетат или урея) и могат да имат по-ограничени метаболитни способности.
Общ брой TRF в 12 C лента (линия) и в 13 C лента (сиви ленти) за пикове, представляващи повече от 2% от профила на общността.
Изображение в пълен размер
От времето на инкубация на нашите SIP експерименти също е възможно да се изчислят параметрите за растеж на crenarchyy in situ. Ако приемем, че са необходими две дублирани събития за пълна 13 С-маркирана ДНК и откриване в нашата 100%-маркирана 13 С-носителна лента, това предполага, че физиологичният уринарен уред има време за удвояване от порядъка на 2 до 2,5 дни. Предишни проучвания са измервали скоростта на растеж на култивирани кренархеи с амонячно окисление (Könneke et al., 2005) и/или получени удвояващи времена чрез определяне на броя на копията на 16S рРНК (Park et al., 2010). Тези доклади показват максималната скорост на растеж на амонячно окисляващи археи (AOA) в течната среда при 25-28 ° C между 0,57 и 0,78 на ден (или удвояване между 1,28 и 1,75 дни). Напротив, нашите констатации са в съответствие с предишни наблюдения на малко по-бавен темп на растеж на утайките (0, 2 на ден, Mosier et al. (2012)). Тези резултати обаче могат да бъдат надценяване на потенциалния темп на растеж, тъй като SIP изисква всички прекурсорни части за синтеза на ДНК да бъдат равномерно маркирани с 13C за откриване.
В заключение, много мезотермални Crenarchaea (Thaumarchaea) в седиментите на солените блати асимилираха широк спектър органични субстрати с 13 C-субстрата, за да възпроизведат своите геноми. Други кренархеи са били много по-селективни в 13-те източника на въглерод, използвани за растеж. Подходът SIP демонстрира солени блата, които могат да се използват за изследване на метаболитните способности на кренархията и могат да помогнат за определяне на лабораторни условия за изолиране на тези хетеротрофни микроорганизми. Веднъж в чиста култура, традиционните микробиологични техники могат да бъдат използвани за подобряване на нашето разбиране за физиологичните способности на кренархеите. И накрая, експериментите, които директно свързват моделите за използване на въглерод с конкретни членове на микробната общност, могат да дадат представа за конкурентната връзка между кренархаите и бактериите и да подобрят нашето разбиране за микробната екология.