елементи
абстрактно
Тук представяме количествена оценка на ефектите на AgNP върху биомасата, фотосинтетичната активност, клетъчната морфология, мембранната пропускливост, естеразната активност и окислителния стрес на представителна почвена водорасли Chlamydomonas reinhardtii 23 в почвата. Този подход може да осигури ефективно средство за оценка на потенциалната токсичност на наноматериалите въз основа на отговора на почвените водорасли и количествената индикация за токсичността на AgNP в почвата.
методи
Тествайте видове и предкултура
Chlamydomonas reinhardtii е получена от Тексаския университет, Остин, САЩ. Клетките от водорасли се инкубират в трис-ацетат-фосфатна среда, като се използват 250 ml боросиликатни стъклени колби с въздухопропускливи запушалки и се култивират при 24 ± 2 ° C, разклащане при 100 r/min и 16: 8 h (светлина: тъмно) - фотопериод осигурени от ярки бели флуоресцентни лампи (
реагенти
AgNP прах (17. Проби (1 g) почва се прехвърлят в 6-ямкова микроплака с плоско дъно (диаметър 35 mm, височина 22,5 mm за всяка ямка)) се добавя дейонизирана вода, за да се регулира съдържанието на влага в тестваната почва на 90% от нейния капацитет за задържане на вода Веднага след като тестовата среда беше наситена с дейонизирана вода, 0.13 ml C. reinhardtii по време на експоненциален растеж (т.е. първоначална плътност 6.5x105 клетки/g в тестовата среда) бяха инокулирани върху повърхността на почвата от три проби. 0,13 ml дейонизирана вода (вместо суспензия от водорасли) се добавят по същия начин, за да се коригира фоновата флуоресценция в анализа на биомасата или да се изключат ефектите на фините почвени твърди вещества в поточната цитометрия. Микроплаките се инкубират в продължение на шест дни при същите условия на предкултура, при които C Освен това към кладенците се добавят необработени почви и серийни разтвори на йонен Ag, за да се оцени токсичността на йонен Ag по същия начин като третирането. AgNP или насипна почва, обработена с Ag и AgNP. По същия начин в контролите се използва дейонизирана вода вместо йонна Ag.
Извличане на почвени водорасли от AgNP, насипни Ag или йонни почви
За извличане на непокътнати C. reinhardtii, отглеждани във всяка среда, към всяка почвена проба се добавят 5 ml от Bold's базалната среда (BBM) и след това микротитърната плоча се разклаща в продължение на 24 часа при предпокултурни условия. Получената супернатанта се използва за анализ на биомаса, фотосинтеза и поточна цитометрия след 5-минутен период на утаяване.
Анализ на биомасата
За да се извлече хлорофил а от C. reinhardtii, суспензията от водорасли се смесва с етанол (съотношение 1: 4 водорасли: етанол) и се разклаща на тъмно в продължение на 3 часа при условия на предкултура. Флуоресценцията на хлорофила е измерена за количествено определяне на биомасата на водорасли, като се използва флуоресцентен четец на микроплаки (Gemini; Molecular Devices, Сънивейл, Калифорния, САЩ) при дължина на вълната на възбуждане 420 nm и дължина на вълната на излъчване 671 nm24.
Фотосинтетични анализи
За да се анализира фотосинтетичният капацитет на C. reinhardtii, суспензията на водораслите се оставя да се настрои на тъмнина за 15 минути. След това беше използван Handy Plant Efficiency Analyzer (PEA; Hansatech Instruments Ltd., Kings Lynn, Norfolk, UK) за анализ на параметрите на системата на Photosystem II: обща допълваща площ (площ), максимален квантов добив на първична фотохимия (при t = 0) ( Fv/Fm), реакционен център за абсорбционен поток (RC/ABS), реакционен център за улавен енергиен поток (при t = 0) (RC/TRo), електронен транспортен поток на един реакционен център (при t = 0) (ETo/RC) и реакционен център с разпръснат енергиен поток (при t = 0) (RC/Dio) 25, 26 .
Проточна цитометрия
Микроскопски анализи
Анализ на данни
Процент биомаса, фотосинтеза, размер на клетките, клетъчна гранулираност, естеразна активност, оксидативен стрес и мембранна пропускливост за всяка концентрация на AgNP, насипни Ag и йонни Ag са нормализирани към контролната група. Данните бяха анализирани с помощта на теста на Dunnett и разликите при p 35 и AgNP 36 с полимерно покритие .
Chlamydomonas reinhardtii биомаса след излагане на сребърни наночастици (AgNP) в продължение на шест дни. Баровете представляват стандартното отклонение на средната стойност на шест повторения. Звездичките (*) показват значително различни стойности в сравнение с контролните стойности (p 37, инактивиране на реакционния център 38, 39 и принос за по-голямо намаляване на QA до Q ° във фотосистема II 39). Областта беше най-чувствителната крайна точка сред фотосинтетичните крайни точки (Таблица Докато фотосинтезата на водорасли не е била оценявана в предишни проучвания за обработени с AgNP почви, някои проучвания съобщават за фотосинтетично инхибиране на C. reinhardtii в отговор на покрит с въглероден диоксид AgNP 1, девет покрити с AgNP типове 21 и други AgNP 40, 41 в течна среда, обработена с AgNP.
Клетъчна морфология (размер и гранулираност) на Chlamydomonas reinhardtii след излагане на сребърни наночастици (AgNP) в продължение на шест дни. Стълбовете представляват стандартното отклонение на средната стойност (n = 6-12). ( A ) Хистограма на поточната цитометрия и ( Б. ) Контурна крива на поточната цитометрия. Звездичките (*) показват резултати, които се различават значително от резултатите от контрола (стр
Леки микрофотографии на Chlamydomonas reinhardtii след излагане на сребърни наночастици (AgNP) в продължение на шест дни. ( A ) C. reinhardtii, адсорбирани върху необработена почва, Б. ) C. reinhardtii, адсорбиран върху 50 mg обработена с AgNP почва/kg, ( ° С ) C. reinhardtii, суспендирани в необработени почвени екстракти, д ) C. reinhardtii, суспендирани в 50 mg AgNP/kg обработени почвени екстракти, Е. ) C. reinhardtii, суспендирани в необработени почвени екстракти след оцветяване с нигрозин и ( F ) C. reinhardtii, суспендиран в 50 mg AgNP/kg обработени почвени екстракти след оцветяване с нигрозин. Черните стрелки показват частиците на почвата. Сините стрелки показват слузести случаи.
Изображение в пълен размер
Изображения с електронен микроскоп с полеви емисии на Chlamydomonas reinhardtii след излагане на сребърни наночастици (AgNP) в продължение на шест дни. ( A ) C. reinhardtii, адсорбирани върху необработена почва, Б. ) C. reinhardtii, адсорбиран върху 20 mg обработена с AgNP почва/kg, ( ° С ) C. reinhardtii, адсорбиран върху 50 mg обработена с AgNP почва/kg, ( д ) C. reinhardtii, суспендирани в необработени почвени екстракти, Е. ) C. reinhardtii, суспендирани в 20 mg AgNP/kg обработени почвени екстракти и ( F ) C. reinhardtii, суспендиран в 50 mg AgNP/kg обработени почвени екстракти. Сините стрелки показват слузести обвивки, направени от водорасли, а червени стрелки - фрагменти от слузеста обвивка.
Изображение в пълен размер
Електронно-емисионна електронна микрофотография (FE-TEM) изображения и енергийно дисперсионни рентгенови спектроскопски детектори (EDX) на Chlamydomonas reinhardtii изображения в почвата, обработена с 50 mg AgNP/kg. ( A ) FE-TEM. ( Б. ) EDX изображенията показват елементарното разпределение на Ag, S, C, N и O в квадрат с червена точка, скициран от разширена микрофотография FE-TEM от панел А. ( ° С ) EDX спектърът показва елементарен анализ (C, N, O, S и Ag, както е показано със сини кръгове над жълтите върхове). Жълто пунктиран правоъгълник показва наличието на Ag в C. reinhardtii .
Изображение в пълен размер
Ефекти на почвите AgNP върху пропускливостта на водорасловите мембрани, активността на естеразата и оксидативния стрес
Пропускливост на клетъчната мембрана ( A а Б. ), естеразна активност ( ° С а д ) и оксидативен стрес ( Е. а F ) Chlamydomonas reinhardtii след излагане на сребърни наночастици (AgNP) в продължение на шест дни. Стълбовете представляват стандартното отклонение на средната стойност (n = 6-12). Звездичките (*) показват резултати, които се различават значително от резултатите от контрола (p PVP покрити AgNPs> Ag частици микрочастици 58, 59. Те посочват, че механизмът на токсичност е относителната повърхност и Ag йони, разтворени от Ag nano. В това проучване, няма значително разтваряне на Ag йони от обработена с AgNP почва и лигавица на C. reinhardtii, суспендирана в почвени екстракти от 50 mg Ag/kg и 30 mg Ag йон/kg Чувствителността към Ag йонната токсичност е по-висока, докато чувствителността към Ag насипно състояние токсичността е по-ниска Следователно, заключаваме, че токсичността на C. reinhardtii в обработена с AgNP почва зависи изключително от размера на частиците (нано), а не от Ag като цяло.
заключения
И накрая, има няколко измерими ефекти на AgNP върху почвените водорасли C. reinhardtii в почвената среда: (i) производство на лигавични обвивки, (ii) инхибиране на биомасата, (iii) частично инхибиране на фотосинтетичната активност, (iv) увеличаване на размера на клетките, ( v) увеличаване на клетъчната пропускливост на мембраната и (vi) присъствието на Ag в клетките на водораслите. Тъй като производството и потреблението на AgNP продължава да расте, важно е да се изяснят възможните ефекти от продължаващото освобождаване на AgNP в околната среда. По този начин настоящото проучване демонстрира нов и ефективен метод за оценка на токсичността на наноматериалите за почвените водорасли.
Благодаря
Това изследване беше подкрепено от основна програма за научни изследвания чрез Националната изследователска фондация на Корея (NRF), финансирана от Министерството на науката, ИКТ и бъдещото планиране (2016R1A2B3010445). Тази работа беше подкрепена и от Корейския институт по околна среда и технологии (KEITI) чрез „Проект за развитие на предотвратяването на химически аварии“, финансиран от корейското министерство на околната среда (MOE) (№ 2016001970001). Благодарим на Корейския институт за наука (KBSI) за FE-TEM, анализатор на повърхностна площ, FE-SEM, EDX и ICP-MS анализи. Специални благодарности на Miri Choi и Myeong Seon Jeong за помощта при анализа на FE-TEM.
Електронен допълнителен материал
Допълнителна информация
Коментари
Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако смятате, че това е обидно действие, което не отговаря на нашите условия или насоки, моля, сигнализирайте за неподходящо.