регулаторния

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Генериране на специфични за епидермиса мишки с дефицит на A20
  • A20 EKO мишки показват кератиноцитна хиперплазия
  • Мишките A20 EKO показват аномалии в ектодермалните добавки
  • A20 действа като регулатор на EDA пътя за активиране на NF-κB
  • дискусия
  • Допълнителна информация
  • Файлове с изображения
  • Допълнителна фигура 1
  • Word документи
  • Допълнително изображение 1 Легенда
  • Терминологичен речник

елементи

абстрактно

Основното

Епидермисът се състои главно от кератиноцити, разположени в различни слоеве. Базалните кератиноцити са митотично активни и осигуряват нови клетки, които постепенно се подлагат на диференциация към повърхността на кожата, където те царевичат и се разцепват. Този добре организиран биологичен процес е строго контролиран и нарушаването на последователността от събития може да доведе до различни кожни нарушения, включително възпаление и рак. Точният контрол на транскрипционния фактор на ядрения фактор KB (NF-kB) е от съществено значение за поддържане на хомеостазата на кожата, както се вижда от факта, че прекомерната активност на NF-kB B, както и аблация на основни активатори на NF-kB B водят до възпаление на кожата, 1, 2, 3 NF-kB принадлежи към семейство от структурно свързани и еволюционно запазени протеини (p100 или NF-kB B2, p105 или NF-kB B1, p65 или RelA, RelB, c-Rel), които съществуват като хомо- или хетеродимери. В клетките в покой NF-кВ се поддържа неактивен чрез свързване с инхибитор KB (IBB) протеини, от които IκBa е най-изследван. Многобройни стимули водят до фосфорилиране и полиубиквитиниране на IκB протеини, които ги насочват към протеазомно разграждане. Това води до освобождаване на NF-кВ, който се натрупва в ядрото и транскрипционно активира целевите гени.

Основно събитие в NF-κB сигнализирането е активирането на комплекса IkB киназа (IKK), който се състои от две кинази, IKK1 и IKK2 (известни също като IKK α и IKK β), и регулаторен протеин на платформата, NF-κ B основен модулатор (NEMO, известен също като IKK γ). Експериментите, насочени към гените, показват, че IKK2 и NEMO, но не и IKK1, са необходими за активиране на NF-kB B от фактор на туморна некроза (TNF) и Toll-подобни рецептори. 3 Някои рецептори, като лимфотоксин β и CD40 рецептори, могат да активират алтернативен NF-κB път, който включва IKK1 и води до обработката на p100 NF-kB в p52, който образува транскрипционно активен димер с RelB.

Тъй като NF-кВ е от решаващо значение за развитието и възпалението, е необходимо стриктно регулиране на неговото активиране. Този строг контрол се постига чрез комбинираното действие на положителните и отрицателните регулатори. През последните години убиквитинацията и деубиквитацията (DUB) на няколко NF-κB сигнални компонента бяха идентифицирани като основни стъпки в контрола на NF-κB сигналните пътища. Една критична спирачка при активирането на NF-кВ е ензимът убиквитин А20, който е характеризиран като инхибитор на активирането и апоптозата на NF-кВ В. A20 е необходим за прекратяване на NF-кВ сигнализиране в отговор на TNF и микробни продукти като липополизахарид и мурамил дипептид. Значението на in vivo противовъзпалителните дейности на A20 се илюстрира от тежкото възпаление на множество органи и перинаталната смърт, наблюдавана при A20 -/- мишки. 24 Последните генетични проучвания показват връзка между гена на гена на гена на протеин 3, индуциран от човешкия фактор A20/α (TNFAIP3) и автоимунната патология и псориазис, което предполага, че A20 може да играе важна роля при автоимунни и възпалителни заболявания при човека. Тези открития подчертават значението на A20 в контрола на нормалната тъканна хомеостаза и го идентифицират като потенциална цел при лечението на много възпалителни патологии, включително псориазис.

Използвахме K14-управлявано Cre/LoxP-медиирано генно насочване при мишки, за да изследваме in vivo функцията на A20 в епидермалното развитие и хомеостазата. Ние показваме, че A20 е от съществено значение за контрола на пролиферацията на кератиноцити и за правилното развитие на ектодермални маркери. Нашите данни показват, че специфично за кератиноцитите делеция на A20 води до EDA-A1-индуцирана свръхекспресия на NF-κB, което води до феноскопска трансгенна EDA-A1 мишка.

резултатът

Генериране на специфични за епидермиса мишки с дефицит на A20

За да идентифицираме специфични за тъканите функции на A20, генерирахме мишки, носещи условния алел A20, при които екзони IV и V на мишия ген A20 са фланкирани от LoxP места. 26 За да изследваме функцията на A20 в дермални и епидермални добавки, ние прекосихме мишки A20 FL/FL с трансгенна миша линия, която експресира Cre под контрола на човешкия кератин 14 ген промотор (K14-Cre). 27 Епидермални мишки с A20-нокаут, специфични за кератиноцити (A20 EKO), са родени с нормална Менделова сегрегация (данните не са показани). За да проверим специфичната за кератиноцитите делеция на A20 при A20 EKO мишки (Фигура 1а), потвърдихме чрез анализ на Southern blot, че Cre-медиираната рекомбинация е ефективна в епидермиса и първичните кератиноцити (Фигура 1b). В резултат на това не можахме да открием ендогенен A20 в епидермални екстракти от A20 EKO мишки (Фигура 1в).

Поколение на A20 ECO мишки. а ) Снимка на мишка A20 EKO и контролна мишка A20 FL/FL. ( б ) Southern blot анализ на ДНК от епидермис и дерма от A20 EKO мишки и ДНК от изолирани кератиноцити A20 FL/FL (WT) и A20 EKO мишки. ( ° С ) Епидермални екстракти от тъканни протеини, получени от специфични за кератиноцити нокаути (A20 EKO) бяха анализирани чрез Western blot с A20-специфично антитяло. Протеиновата лента A20 е обозначена със стрелка, звездичката (*) показва неспецифични ленти

Изображение в пълен размер

A20 EKO мишки показват кератиноцитна хиперплазия

Не са наблюдавани макроскопични признаци на възпаление на кожата, като зачервяване, лющене или прекомерно надраскване поради сърбеж при мишки A20 EKO (Фигура 1а). Хистологичният анализ на дорзалните кожни участъци показва засилен епидермис поради повишена пролиферация (2,5 пъти) на базалните клетки (Фигура 2), но подобни много ниски нива на апоптоза (данните не са показани). Експресионните модели на диференциращите маркери каспаза-14, филаггрин и кератин 10 са нормални и не се наблюдават инфилтриращи имунни клетки (данните не са показани). Тези данни предполагат, че липсата на A20 не води до спонтанно възпаление на кожата или че други DUB ензими, като цилиндроматоза (CYLD), 28 действат прекомерно, за да предотвратят спонтанно възпаление.

A20 EKO показва лека кератиноцитна хиперпролиферация. ( а ) Части от гръбната кожа на мишки A20 FL/FL и A20 EKO бяха оцветени с хематоксилин и еозин и анализирани чрез светлинна микроскопия (скала: 100 μm). ( б ) Ki-67-положително оцветяване (тъмнокафяви ядра) на гръбни кожни участъци от мишки A20 FL/FL и A20 EKO (колона с мащаб: 100 μm). ( ° С ) Количествено определяне на процента на ки-67-положителни кератиноцити от базалния слой в части от гръбната кожа на мишки A20 FL/FL и A20 EKO.

Изображение в пълен размер

Мишките A20 EKO показват аномалии в ектодермалните добавки

Пликът на мишки A20 EKO беше дезорганизиран (Фигури 1а и 3а). Този разрошен фенотип на косата никога не е наблюдаван в контролни кладенци A20 FL/FL. Мишките са наблюдавани до 12-месечна възраст и не показват данни за загуба на коса или алопеция. Мишки A20 FL/FL също преминаха през трансгенната линия K5-Cre, 29 с която се наблюдава подобен фенотип (данните не са показани). Всички други експерименти бяха проведени върху мишки A20 FL/FL/K14-Cre. 27

Мишките A20 EKO имат по-тънка коса с увредена кутикула. а ) Изображение на козина на мишки AKO FL/FL и A20 EKO. ( б ) Косата от гърба на мишки A20 FL/FL и A20 EKO е епилирана. Микроскопското изследване показва наличието на предпазна коса, козина от коса, крива коса и косми от коса при контролни мишки A20 FL/FL. Мишките A20 EKO имат само права или къдрава коса. ах, слаба коса; au, auchen коса; gh, охрана на косата; zz, крива козина. ( ° С а д ) SEM изображение на коса от мишки A20 FL/FL и A20 EKO (колона с мащаб: 10 μm). ( д а е ) ТЕМ секции през задната кожа на мишки A20 FL/FL и A20 EKO, показващи подробности за секцията на космения фоликул (скала на скалата: 500 nm). Мишките A20 EKO имат хиперплазиран и дезорганизиран кожен слой. h, косми; c, кутикуларен слой

Изображение в пълен размер

Други характеристики на фенотипа A20 EKO, който фенотип EDA трансгени. а ) Снимка на лапите, наблюдавана под бинокулярен микроскоп, показва, че мишките A20 EKO имат по-дълги нокти от контролните носилки. ( б ) Макроскопичният анализ на опашката показва повече вълнообразни косми от опашката и по-големи гънки, подобни на мишки A20 EKO. ( ° С ) Себоцитите в кожни участъци от A20 EKO и контролните мишки бяха оцветени с анти-адипофилиново антитяло. (Скала: 500 μm.) ( д ) Площите на участъците през мастната жлеза бяха определени въз основа на това оцветяване с помощта на софтуер за анализ на изображения Volocity и бяха сравнени средните повърхностни площи в A20 EKO и контролни мишки.

Изображение в пълен размер

A20 действа като регулатор на EDA пътя за активиране на NF-κB

Тъй като загубата на A20 в кожата води до частична феноскопия на EDA-A1 свръхекспресиращи мишки с епидермиса, предположихме, че A20 може да бъде отрицателен регулатор на пътя на EDA. В действителност, използвайки NF-κB-зависима репортерна луцифераза (Luc), ние демонстрирахме, че A20 блокира индуцирана от EDAR NF-κB активиране в клетки HEK293T в подобна степен като TNF-индуцираната NF-κB B активация (Фигура). 5а). Използвайки делеционни мутанти, можем да демонстрираме, че индуцираното от EDAR активиране на NF-κB е инхибирано от съдържащия A20 С-краен домен на Z20, но не и от N-крайния DUB домен (Фигура 5b и допълнителна фигура). 1), което показва, че DUB активността не е необходима за инхибиране на NF-κB активиране. За да проверим това, тествахме и двуточков мутант (A20 D100A/C103A), който няма активност DUB 32 (Фигура 5в и Допълнителна Фигура 1). A20 D100A/C103A е също толкова ефективен, колкото дивия тип A20, за инхибиране на индуциран от NF-кВ EDF, потвърждавайки, че за този ефект не се изисква активност на A20 DUB.

Стимулирането на EDA-A1 предизвиква експресия на A20 по време на развитието на плака на косата. а ) Експресията на A20 се визуализира чрез in situ хибридизация на EDA-дефицитни ембриони и на WT E14, тъмносинкав цвят, показващ положителен сигнал in situ. Десният панел показва вибриращ изрез с плака за коса (стрелка). ( б ) Цялата in situ хибридизация е извършена върху ембриони E12, като се използва антисензорна сонда за A20 (леви панели) или Wnt10b (десни панели) като положителен контрол за изразяване в зъбната плака (горни панели) и пъпката на гърдата (долни панели) . F, предни крака; Н, заден крайник; I, нож плакод; м, пъпки на гърдите; М, моларен код; T, език

Изображение в пълен размер

дискусия

Подобно на IkBα, A20 е важен отрицателен регулатор на NF-κB сигнализиране и възпаление. 25 Начините им на действие обаче са напълно различни. IkBa функционира, за да се свързва директно с NF-κB и да се отделя от ядрото, докато A20 е ензим за редактиране на убиквитин, който инактивира множество цели в NF-κB пътя. IKBa винаги присъства в нестимулирани клетки, за да ограничи неконтролираното активиране на NF-kB B при липса на специфичен възпалителен спусък. За разлика от това, в повечето нестимулирани клетки експресията на A20 е слаба, но силно индуцирана при активиране на NF-kB сигнализиране. Тъй като експресията на IkBa допълнително се индуцира при задействане на NF-κB, както IkBa, така и A20 участват в цикъла за отрицателна обратна връзка при активиране на NF-κB. Хиперинфламацията при IkBα или пълни нулеви мишки A20 и тяхната преждевременна смърт показват критични функции на IkBa и A20 в регулацията на NF-κB. 24, 35, 36, 37

Прекомерното NF-κB сигнализиране в кожата, като например в кератиноцити, специфични за IκB а-нокаутиращи мишки и K5-IKK2 трансгенни мишки, предизвиква дерматит. 37, 38 Неочаквано, въпреки че A20 EKO мишките развиват епидермална хиперпролиферация, те не развиват спонтанно възпаление. Наличието на функционален IKBa може да е достатъчно за контролиране на незначителни възпалителни реакции срещу обиди от околната среда. Алтернативно, излишните DUB ензими, които контролират NF-κB активиране, като CYLD, могат да бъдат активни в кожата. Въпреки че CYLD е виден в епидермиса, CYLD -/- мишките не показват кожни аномалии. 28 Аблация на A20 и CYLD може да се наложи при спонтанен тежък дерматит.

Ние показваме, че специфичното за епидермално изтриване на A20 води до множество аномалии в ектодермалните органи, подобни на свръхактивиране на EDA пътя. 18, 19, 20, 21, 22, 39 Приликата на A20 EKO мишки с мишки, свръхекспресиращи EDA-A1 или EDAR и инхибирането на EDAR сигнализиране от A20 in vitro категорично предполага, че хиперактивацията на EDA пътя е основната причина за A20. ЕКО фенотип. Това заключение се подкрепя допълнително от нашето откритие, че EDA-A1 индуцира експресия на A20 и че A20 иРНК се локализира съвместно с Edar и NF-κB сигнална активност в развитието на космения фоликул. Известно е, че A20 инхибира NF-кВ сигнализирането, индуцирано от различни сигнални пътища, и е доказано, че зависи от DUB активността на своя OTU домейн и от лигирането на убиквитин на С-крайните Zn-пръсти. Бихме могли да покажем, че активността на DUB A20 не участва в инхибирането на EDAR сигнализирането.

Приликите между A20 EKO мишки и EDA-A1-трансгенни мишки включват дефекти на ноктите и косата и хиперплазия на мастните жлези. Допълнителни зъби и зърна също са разработени за EDA-A1 трансгеника, но тези аномалии никога не са наблюдавани при AKO EKO мишки. Възможно е сигнализирането на EDA-A1 да не се регулира от A20 на тези места, което корелира с липсата на откриваема експресия на A20 в кодовете на плаките на зъбите и пъпките на гърдата. Възможно е също така, че образуването на прекомерни зъбни и гръдни пъпки изисква по-силна активност на EDAR, което може да се постигне чрез прекомерно производство на лиганд, но не и чрез премахване на механизма за отрицателна обратна връзка, който отслабва сигнализирането. Друго обяснение е, че K14-Cre-медиираното заличаване на A20 може да е настъпило твърде късно, за да позволи индукция на ектопични примордии на органи, тъй като експресията на K14-Cre е най-силна при E15, докато индукцията на зъбни и млечни кодове започва от E11 до E12. 41

В заключение установихме, че A20 е индуциран от EDA-A1 протеин, който действа като инхибитор на EDAR-зависима NF-кВ сигнализация, независимо от неговата DUB активност. Следователно, генетична делеция на A20 в кератиноцитите засяга нормалното развитие на епидермалния маркер, подобно на това, наблюдавано при трансгенни мишки, свръхекспресиращи EDA-A1 или EDAR.