елементи

абстрактно

Основното

80% от фоликуларния лимфом от възрастен тип при липса на експресия на протеин BCL2. Наскоро Martin-Guerrero et al. описва повтаряща се загуба на хетерозиготност при 1p36 и връзка с мутации на TNFRSF14 при малка част от пациентите с педиатричен фоликуларен лимфом. 6

Сравнително, произтичащи от В-клетки на следгенералния център на паметта, детският лимфом на възловите периферни зони споделя сходни архитектурни и имунофенотипни характеристики с възрастния тип; въпреки това, маркираният и характерен лимфом на педиатричната възлова маргинална зона показва преобладаване на мъжете (приблизително 20: 1) и е локализиран най-вече в областта на главата и шията. 7, 8 Този лимфом е заболяване от етап 1 и има отлична прогноза и като цяло ниска честота на рецидиви. Съобщени са генетични аномалии в пределната зона на детските лимфни възли, като най-честата промяна е тризомия 18 (17%), което също е често срещана цитогенетична аномалия, установена при лимфом на лимфома от възрастен тип. 10, 11 Както при фоликуларния лимфом от педиатричен тип, окончателната диагноза на лимфома на педиатричните лимфни възли в периферните зони и отделянето от подобни морфологични образувания остава предизвикателство.

Поради тенденцията към някои припокриващи се характеристики между педиатричния тип фоликуларен лимфом и педиатричния нодален лимфом на маргиналната зона и липсата на литература, описваща генетичния пейзаж на тези различни образувания, извършихме цялостно дълбоко секвениране (> 140-кратно покритие) в 10 дела. педиатрични лимфни възли в периферната зона и фоликуларен лимфом от педиатричен тип, както и секвениране на Sanger в два други случая, за да се характеризира значително мутационно значение на тези редки тумори и да се търсят допълнителни мутации на водача и участващите биологични пътища. Нашият анализ идентифицира нова повтаряща се мутация на соматична точка при детски фоликуларен лимфом в транскрипционния фактор интерферон регулатор фактор 8/интерферон консенсусно свързващ протеин (IRF8/ICSBP), c.197A> G, кодиращ p.Lys66Arg. Други соматични варианти са наблюдавани при фоликуларен лимфом от педиатричен тип и педиатричен нодален лимфом на маргиналната зона, включително мутации в гени, участващи в транскрипцията, вътреклетъчно сигнализиране и клетъчна организация, въпреки че общата честота на несинонимните мутации обикновено е ниска (4,6 мутации на дело).

Материали и методи

Избор на дело

Казуси от Катедрата по патология, Медицински център на Станфордския университет и Детска болница в Сиатъл бяха прегледани между 1996 и 2015 г. за случаи, диагностицирани с лимфом на маргиналната зона или фоликуларен лимфом при пациенти на възраст 13, 14 години. Накратко, ДНК беше извлечена от фиксирана с формалин тъкан. парафин с помощта на Qiagen DNeasy комплекти съгласно протоколите на производителя. Системата за обогатяване на целите Agilent SureSelect Exon V5 е използвана за обогатяване на 51-Mb екзома след секвениране на платформата Illumina Hiseq 2500 V3, използвайки сдвоено крайно сдвояване от 100 bp, с 200 × високо изходно покритие с дължина на четене 2 × 100 PE.

Подравняване, единичен нуклеотиден вариант, вариант на номер на копие и анализ на Indel

Последователност Sanger IRF8

Извършено е секвениране на Sanger за откриване на кандидат вариант на IRF8 с праймери, проектирани с помощта на PrimerQuest; праймерите са изброени в допълнителна таблица S1. Амплифицираната ДНК се секвенира и визуализира с помощта на 4Peaks. 17

Многовидово подреждане и прогнозиране на ефекта с вариант на един нуклеотид

Данните за сравнение на гръбначните животни MULTIZ са получени от браузъра UCSC Genome, идентификатор на отчета: hg38. Преведените региони, съдържащи IRF8 екзон 1 и екзон 2 бяха извлечени и анализирани за запазване на K66. Проведено е триизмерно моделиране на хомологията на структурата на протеина, използвайки SWISS-MODEL, както е описано. Използвани са 18 алгоритми за прогнозиране на PolyPhen-2 и SIFT, както е описано по-горе. 19, 20

резултатът

Последователност на целокомпонентни последователности и анализ на данни за детски фоликуларен лимфом и детски лимфом в периферната зона при деца

За да идентифицираме потенциални мутации на водача, както и да характеризираме мутационния пейзаж на фоликуларния лимфом от педиатричен тип и педиатричния нодален лимфом на маргиналната зона, извършихме цялостно илюстрирано дълбоко секвениране (> 140-кратно покритие) в шест случая на фоликуларен лимфом от педиатричен тип, с една двойка нормални тумори и четири случая на детски възлов лимфом на маргиналната зона. При пациенти на възраст 18 години и под (обхват: 12–18 години) са идентифицирани всички случаи на фоликуларен лимфом от детски тип и лимфни случаи на педиатричната възлова маргинална зона. Случаите са разследвани и морфологичните и имунофенотипни признаци потвърждават съответните диагнози. Демографията на пациентите и клиничните признаци са подробно описани в таблица 1.

Маса в пълен размер

Използвайки нашия аналитичен конвейер, състоящ се от три различни алгоритми за извикване на варианти, Mutect, SNPPET и VarScan, се наблюдава соматично несинонимно мутационно натоварване за всеки случай със средно 4.6 мутации на случай (диапазон 2-13). За да сведем до минимум фалшивите негативи, използвахме по-меки параметри на филтъра, включително минимална честота от 10% от алела и изискването за покриване на 10 четения/покритие на единичен нуклеотид. Идентифицирани са общо 46 несинонимни соматични мутации, които засягат 44 различни гена, включително миссенс мутации и глупости мутации. 3 За педиатричния фоликуларен лимфом идентифицирахме 32 еднонуклеотидни варианта в гени, участващи в транскрипцията, вътреклетъчната сигнализация и клетъчната пролиферация (Таблица 2). Открити са по-малко мутации при детски лимфом с възлова маргинална зона, с 14 нуклеотидни варианта, наблюдавани в гени, участващи в клетъчната адхезия, регулаторните елементи на цитокините и клетъчната пролиферация (Таблица 3).

Маса в пълен размер

Маса в пълен размер

За фоликуларен лимфом от педиатричен тип идентифицирахме повтаряща се мутация на соматична точка c.197A> G, кодираща p.Lys66Arg в регулатора на транскрипционен фактор интерферонов фактор 8/интерферон консенсусно свързващ протеин (IRF8/ICSBP). Този уникален вариант на единичен нуклеотид е идентифициран в три от шестте проби от детски фоликуларен лимфом (Таблица 2). Липсваше съответната проба от нормална тъкан от случай 1. Последователността на Sanger потвърждава варианти с единичен нуклеотид и в трите случая. След това извършихме секвениране на Sanger за откриване на варианта IRF8 за останалите случаи на детски фоликуларен лимфом, всички случаи на детски възлови лимфни зони в периферната зона и 22 случая на фоликуларен лимфом от възрастен тип; тези случаи са отрицателни за c.197A> G в IRF8 (данните не са показани). Не са наблюдавани повтарящи се соматични мутации при лимфома на педиатричната възлова маргинална зона.

IRF8 е член на семейството на IRF на транскрипционни фактори, преобладаващо експресирани в клетките на имунната система, който е член на сложни регулаторни мрежи, допринасящи за хемопоетичната диференциация, регулирането на клетъчния цикъл и апоптозата. Протеинът IRF8 съдържа N-краен ДНК-свързващ домен и С-краен домен на асоцииране на IRF. Промяната на p.Lys66Arg е консервативно заместване на неутрален остатък в ДНК-свързващия домен на IRF8 (Фигура 1а и b): по-специално контур 2, който е С-краен към алфа спирала-2 (Фигура 1b). Въпреки че попада в областта на дългия контур, тази позиция, базирана на екстраполация от силно хомоложен член на семейството IRF4 и кристалната структура на PU.1/IRF4/ДНК комплекса, се смята, че влияе на взаимодействието ДНК-протеин чрез заместване на по-голяма група. В допълнение, оценката на запазването на аминокиселинната последователност в IRF8 в позиция 66 показа 100% идентичност на последователността в сравнение с 97 вида гръбначни животни със свързани геноми (Фигура 1в и Допълнителна таблица S2). В допълнение, PolyPhen2 и алгоритмите за непоносимост към толерантни (SIFT) алгоритми предсказват вреден ефект от промяната на p.Lys66Arg.

среда

Многократна точкова мутация в ДНК-свързващия домейн на IRF8. ( а ) Схематична диаграма на IRF8 протеина с дефиницията на ДНК свързващия домен и асоцииращия домен на IRF. Звездите посочват местоположението и броя на случаите за подмяна на K66R. ( б ) Модел на лента на ДНК-свързващ домен с визуализирана странична верига R66. Вграден, лентов модел с див тип последователност. ° С ) Многовидова подредба на IRF8, включваща екзон 1 и екзон 2 (аминокиселини 1-87) с подобрен консервиран лизин в позиция 66 в множество видове.

Изображение в пълен размер

Копиране на варианти на номера и откриване на синтез

Номерът на копието и/или структурните вариации често са свързани с хематолфоидни неоплазми. Оценихме цял exex набор от сдвоени краища за детски фоликуларен лимфом и лимфом на детски възлови лимфни възли, за да определим промените в броя на копията и геномното сливане и точките на прекъсване. Използвахме CNV-seq, за да идентифицираме вариации на броя на ДНК копия чрез двукратно увеличение или намаляване в сравнение с контрола. Тъй като не всички проби имат сдвоени нормални тъкани, всички проби бяха сравнени със сдвоените хистологично потвърдени неоткрити лимфни възли (нормална тъкан) от случай 1. В този анализ не беше идентифицирано повтарящо се хромозомно място, което да показва големи промени в броя на геномните копия. при фоликуларен лимфом от педиатричен тип или детски лимфом на възловата маргинална зона.

Използвахме описания по-рано софтуерен инструмент Fusion и алгоритъма за хромозомно преместване на транслокация, за да открием геномни пренареждания. Този силно чувствителен и специфичен метод използва сдвоени данни за секвениране на ДНК за бързо идентифициране на транслокации, инверсии и големи делеции. Три структурни вариации бяха идентифицирани в три отделни случая на фоликуларен лимфом от педиатричен тип (Допълнителна таблица S3): два варианта бяха делеции, включващи имуноглобулин капа и променлива област на присъединяване (случаи 4 и 6), а третият беше делеция в тежкия имуноглобулин верижна променлива област (случай 1). Тези делеции вероятно представляват нормални пренареждания на гена на тежката верига на имуноглобулина и гена на имуноглобулин капа (Таблица 1). Не са установени сливания на гени при детски фоликуларен лимфом. Не са установени транслокации, инверсии или делеции при лимфома на педиатричната възлова маргинална зона.

Сравнение с варианти на фоликуларен лимфом при възрастни и възлова лимфна зона маргинална зона за възрастни

Като се имат предвид сходните морфологични и фенотипни характеристики на фоликуларния лимфом от педиатричен тип и детския нодален лимфом на маргиналната зона със съответните типове за възрастни, ние се опитахме да сравним идентифицираните варианти на единичен нуклеотид с публикувани доклади за промени във фоликуларния лимфом от възрастен тип и при възрастни. възлова лимфома на маргиналната зона. Не са наблюдавани мутации при фоликуларен лимфом от педиатричен тип в регулаторните елементи на хроматина (CREBBP, EZH2, KMT2D (MLL2), членове на семейството TNF (TNFRSF14), NF-κB или mTORC1 сигнализиране; 25, 26, 27, 28, обаче, Случай 2, който също съдържа мутация в IRF8, мутация в транскрипционния фактор PAX5, p.Gly183Ala, Тази мутация не се наблюдава в сдвоени нормални тъкани, докато тази мутация в PAX5 не е публикувана преди това при фоликуларен лимфом от възрастен тип. в G183 са идентифицирани при пациенти с В-лимфобластна левкемия

дискусия

За разлика от фоликуларния лимфом от възрастен тип, който показва характерната хромозомна транслокация на BCL2, както и други често срещани хромозомни и генни промени, генетичната основа за развитието на фоликуларен лимфом от педиатричен тип не е ясно определена. 32 Мартин - Гереро и др. Наскоро те съобщиха за повтаряща се загуба на хетерозиготност при 1p36, място, което често се променя при фоликуларен лимфом от възрастен тип, който е свързан предимно с мутации на TNFRSF14. 6 мутации на EZH2 също са докладвани в същата кохорта, осигурявайки известна подкрепа за потенциални генетични механизми като форма за възрастни. Наскоро IRF8 е описан като рецидивиращ мутирал ген в малък процент от случаите на фоликуларен лимфом от възрастен тип. Вариантите са предимно локализирани в С-крайния домейн на IRF8 с неясни функционални последици и не се съобщава за повторна промяна на нуклеотидите. Идентифицирането на специфично заместване на p.Lys66Arg в значителна част от кохортата от фоликуларен лимфом от педиатричен тип до голяма степен показва обща и критична промяна, която води до развитието на заболяването. В допълнение, въпреки че подобен ген е включен между възрастни и педиатрични форми, повтарящите се промени в ДНК-свързващия домейн предполагат потенциално уникален произход на заболяването.

Наскоро е описано, че взаимодействията между IRF8 и IRF4 играят роля на регулатор при инфекцията с вируса на Epstein-Barr. 41 IRF8 и IRF4 взаимодействат директно с N-крайния домен на вирусното антигенно антитяло 3С на Epstein-Barr, което е кодирано от вируса на Epstein-Barr, и образува молекулен комплекс, който стабилизира IRF4 и води до протеазомно зависимо разграждане на IRF8. Обратната връзка между експресията на IRF8 и резистентността към апоптоза чрез Fas-медииран път е описана като корелираща с повишена резистентност към апоптоза и метастатичен потенциал in vitro. Като се има предвид връзката между EBV инфекцията и променената активност на IRF8 с развитието и трансформацията на няколко лимфопролиферативни нарушения, интересно е да се предположи, че IRF8 е критична връзка в лимфомагенезата на много хематопоетични нарушения.

Освен това идентифицирахме мутация в транскрипционния фактор PAX5/BSAP, p.Gly183Ala. Тази аминокиселина, G183, е идентифицирана като важен остатък, мутирал в случаите на В-лимфобластна левкемия. Въз основа на функционални проучвания, мутациите в G183 влияят на транскрипционната активност на PAX5 и променят чувствителността към неоплазия. Ето защо не е изненадващо, че тази мутация може допълнително да повлияе на прогресията и генезиса на фоликуларен лимфом от педиатричен тип. Тази мутация не е присъствала в съответната нормална тъкан, нито е наблюдавана в други случаи на фоликуларен лимфом от педиатричен тип или педиатричен възлов лимфом на маргиналната зона.

Както при фоликуларния лимфом от педиатричен тип, генетичната основа на детския лимфом на възловия ръб не е добре известна. Rizzo et al. Те съобщават за 21% от случаите на детски лимфни възли в периферните зони, които съдържат генетични промени, открити чрез флуоресценция in situ хибридизация и PCR с обратна транскрипция. Водещата аномалия е тризомия 18 (17%), която е описана при нодуларен лимфом на маргиналната зона от възрастен тип. Нашата кохорта не показа промени в номера на копието в подкрепа на тризомията. В случая с AMOTL1 обаче идентифицирахме соматичен вариант при детски лимфом с възлова маргинална зона, която също участва в патогенезата на лимфома на маргиналната зона на далака. Това откритие предполага, че въпреки че педиатричният лимфом на възловата маргинална зона и лимфните възли от възрастен тип могат да споделят някои често срещани генетични аномалии, нашата кохорта е генетично различна от лимфома на лимфома от възрастен тип.

За разлика от нашата педиатрична фоликуларна кохорта, повтарящата се соматична мутация в нашите случаи на детски лимфни възли в възловата маргинална зона не е идентифицирана чрез секвениране на цялата екзома. Тъй като мутационното натоварване е било относително по-ниско в педиатричната възлова маргинална лента на лимфома, отколкото при фоликуларния лимфом от педиатричен тип (3,25 мутации на случай срещу 4,8 мутации на случай), това може да означава, че заболяването може да няма общ и специфичен проводник. Последните проучвания обаче сочат, че соматичните мутации в некодиращи региони могат да съдържат потенциални мутации на водача и дори синонимни промени в гените, кодиращи протеина, могат да играят функционална роля в развитието на тумора. 43, 44, 45 В допълнение, наскоро е доказано, че модификацията на епигенетичния пейзаж при фоликуларен лимфом от възрастен тип чрез мутации в KMT2D метилтрансфераза (MLL2) е пролимфомагенна; възможността некодиращите ДНК мутации или епигенетични промени да доведат до педиатричен нодален лимфом от периферната зона изисква допълнително проучване. 46

Като цяло това е първото описание на широк соматичен мутационен пейзаж на детския фоликуларен лимфом и педиатричния нодален маргинален зонов лимфом. Данните подкрепят различен механизъм на развитие в сравнение със съответното заболяване от възрастен тип, тъй като типична страна на мутация, открита при лимфом на възловата маргинална зона от възрастен тип и фоликуларен лимфом от възрастен тип, не е налице. В допълнение е идентифицирана единична повтаряща се точкова мутация в IRF8 в подгрупа от случаи на фоликуларен лимфом от педиатричен тип, за които се смята, че произвеждат вреден ефект. Предвид функционалната роля на IRF8 в В клетките и транскрипцията, интересно е да се предположи, че тази мутация може да служи като движеща сила в развитието на водача.