имунохистохимия

  • елементи
  • абстрактно
  • Основното
  • Материали и методи
  • Протокол
  • Оценка на случая и последващи действия
  • имунохистохимия
  • Приготвяне на замразени части
  • резултатът
  • Клинични признаци
  • Периферна имунохистохимия
  • Група пациенти
  • Замразени секции
  • дискусия

елементи

  • Колониални заболявания
  • диагноза
  • имунохистохимия

абстрактно

Основното

Вродената аганглионоза на червата или болестта на Hirschsprung е резултат от малформация на ентералната нервна система. Адекватната подвижност на стомашно-чревния тракт изисква инервация от правилно развита и зряла ентерална нервна система. Липсата на вътрешни ганглиозни клетки от дисталния ректум и променливата дължина на съседното черво са желана диагностична характеристика на болестта на Hirschsprung. При ембриологичното развитие чревните нервни влакна мигрират каудално с вагусни влакна и пристигат в дебелото черво в рамките на 12 седмици. Преди десет години беше установено, че загубата на функционални мутации в няколко гена, включително устната на ret прото-онкогена, участва в развитието на аганглиоза. 1 Тези мутации „загуба на функция“ са известни не само, че влияят върху развитието и миграцията на ганглиозните клетки, но също така участват в ранната смърт на ганглиозните клетки. 2

Изследване на ректални биопсии за наличие или отсъствие на ганглиозни клетки се извършва при пациенти, за които се подозира, че имат болест на Hirschsprung. В някои случаи идентифицирането на ганглиозни клетки може да бъде трудно, особено при популацията с най-висок риск от развитие на новородено с болест на Hirschsprung. При тези пациенти незрелите ганглиозни клетки могат да бъдат объркани с ендотелни клетки, други мезенхимни клетки и възпалителни клетки. Поради тази причина много институции използват хистохимично оцветяване с ацетилхолинестераза върху замразена ректална тъкан като допълнение към диагнозата аганглиоза. Точната диагноза на тези петна от замразени филийки обаче изисква високо ниво на опит, особено в неясни случаи. 3, 4 Алтернативно, идентифицирането на невронна хипертрофия може да бъде полезна допълнителна диагностична модалност в случай на аганглиоза. Съобщава се, че 90% от ректалните биопсии при пациенти с болест на Hirschsprung имат подмукозни нервни щамове с диаметър приблизително 40 μm. 5

В резултат на тези диагностични проблеми се развиха редица имунохистохимични петна, които помагат за идентифициране на ганглиозни клетки. Антитела срещу невроноспецифична енология (NSE), 6, 7, периферни, 7, 8, 9, 10 катепсин D, 8, 11 bcl-2, 12 NeuN, 13 костен морфогенетичен протеинов рецептор IA (BMPRIA), 14 неврофиламент, 7, 15 тубулин, 15 онкопротеин на устните, 16 и по-наскоро MAP-2 17 бяха успешни в подчертаването на ганглиозни клетки, които е трудно да се идентифицират с оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E).

През 2002 г. разработихме и внедрихме протокол, използващ периферно имунохистохимично оцветяване, комбинирано с оценка на H&E за идентифициране на ганглиозни клетки при ректални биопсии. След като изучихме литературата, избрахме периферни за подобряване на ганглиозните клетки, тъй като те показаха силно оцветяване на ганглиозните клетки в чревните тъкани на възрастни и деца. Забелязахме, че има леко имунооцветяване на гранулираните нервни влакна; обаче никога не е било трудно да се разграничи това оцветяване от типичното плътно цитоплазматично оцветяване на отделни и ганглийни клетъчни клъстери. Извършихме и имунохистохимично оцветяване на S-100 като добавка за идентифициране на нервна хипертрофия. Ето резултатите от нашия протокол за последните 7 години.

Материали и методи

Протокол

Протоколът се състои от осем нива на H&E, две периферни антитела и два S-100 имуноанализа. Необработени слайдове за имунооцветяване са получени на нива 3, 4 и 8, 9 в блока. Освен ако ганглийните клетки не бяха идентифицирани по оригиналния протокол, бяха извършени допълнителни H&E и периферно оцветяване.

За седемгодишен период 10 патолози от нашата институция интерпретираха тези ректални биопсии. Ако в първоначалния протокол нямаше ганглиозни клетки, имаше разлики между диагностициращите патолози в броя на допълнителните нива на H&E и имуностаините, които биха уредили. Броят на поръчаните H & Es варира от още 10 нива до серийни секции през блока.

Оценка на случая и последващи действия

След одобрение от Институционалния съвет за преглед, всички биопсии, получени за изключване на болестта на Hirschsprung, са получени от Патологичния архив на Медицинския факултет на Грузия от 2002 до 2009 г. Всички случаи са диагностицирани с помощта на протокол за имунохистохимично оцветяване на перинин и S-100 . Всеки случай беше оценен за наличие или отсъствие на ганглиозни клетки и хипертрофия на нервите. Ако са налице ганглиозни клетки, ние определяме дали те са били открити при първоначалния протокол или при многократни нива. Ако липсват ганглиозни клетки, ние оценяваме резекционни проби за наличие или отсъствие на сегмента на агангли. Наличното проследяване е получено с помощта на анализи на графики на пациента. Освен това беше извършен преглед за оценка на пациенти, които са претърпели замразени секции.

имунохистохимия

Имунохистохимията се извършва след депарафинизация на ксилол на репликационни секции и при използване на стандартния метод на авидин-биотин комплекс. Използвани са антитела срещу следните антигени: периферни (PJM50 моноклонални; 1: 100; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) и S-100 (поликлонални; 1: 6000; Dako Corporation, Carpenteria, CA, USA). Събирането на антиген за периферна имунохистохимия включва топлина на тенджерата под налягане с целево отчитане на рН 6, 0. Не се използва предварителна обработка за имунохистохимия S-100.

Имунологичното оцветяване на периферията се счита за положително, ако е идентифицирано характерно цитоплазматично оцветяване на ганглиозни клетки в нервния плексус (Фигури 1а и b). Максималният диаметър на субмукозните нервни влакна се определя чрез имунооцветяване със S-100 чрез визуална микрометрия. При ганглионно-положителни случаи се внимаваше да не се измерва луковичното разширение на нервните влакна, докато течеха през ганглиите (Фигура 1г).

а ) Типично имунооцветяване на клъстери от периферни ганглиозни клетки (× 40). б ) Периферно оцветяване на ганглиозни клетки със зърнести отлагания в нервния сноп (стрелка) на входа на ганглия (х 100). ° С ) слабо линейно и гранулирано имунооцветяване на малки нервни снопчета в субмукозата (стрелки) (× 40). ( д ) Отрицателно оцветяване на ганглиозни клетки при пациент без пациент на Hirschsprung със S-100 имунооцветяване (x 100).

Изображение в пълен размер

Приготвяне на замразени части

Получените тъкани за замразени секции бяха нарязани на 5 μm участъци съгласно стандартен протокол. Едно стъкло се фиксира в 95% етанол и се оцветява с H&E. Втората пързалка се оставя да изсъхне на въздух и се оцветява със стандартен протокол Diff Quick.

резултатът

Клинични признаци

138 последователни случая са избрани за оценка. Два случая не са диагностицирани поради липса на субмукозна тъкан и не се извършват повторни биопсии. В останалите случаи имаше 90 мъже и 46 жени. Сто и девет пациенти са имали ганглиозни клетки, от които 66 мъже и 43 жени. От 27 пациенти без ганглиозни клетки, 23 са мъже и 4 са жени, което съответства на мъжкото преобладаване на болестта на Hirschsprung.

Пациентите са на възраст от 2 дни до 55 години. Четиридесет и един (41%) пациенти с ганглиозни клетки, присъстващи на възраст 1, 2, 3 и по искане на хирурзи, са имали повторни биопсии на ганглиозни клетки. Един пациент с цефокална перфорация и ганглиозни клетки бяха идентифицирани в допълнението и допълнението. Последвалата ректална биопсия беше положителна за ганглиозните клетки. Един пациент е подложен на предсърдна дистална резекция на дебелото черво с потвърждение на ганглиозни клетки в резецирания сегмент. Последвалата ректална биопсия беше положителна за ганглиозните клетки.

Имунохистохимичното оцветяване на S-100 може да бъде оценено при 107 пациенти с ганглиозни клетки (среден диаметър 20 μm (диапазон 8-55 μm)). 103 от тях скриха снопове нерви

а ) Имунологичното оцветяване на S-100 подчертава нервната хипертрофия при пациент с болест на Hirschsprung (× 40). ( б ) Повишени нервни фибрили на мускулната лигавица и ламина, причинени от пациент с болест на Hirschsprung при оцветяване S-100 (× 100). ° С ) Дифузното оцветяване Quik разкрива яркосиня ганглиоцитна цитоплазма (x 40). д ) проверка на замразения участък с помощта на H&E (× 20).

Изображение в пълен размер

Замразени секции

Направени са анализи на замразени разрези на 26 пациенти. От тези 26, 22 пациенти са имали резекции за болестта на Hirschsprung, двама са имали повторни биопсии (интраоперативно потвърждение за наличието на ганглиозни клетки) и двама са имали de novo биопсии. Протоколът Diff Quick оцветява цитоплазмата на ганглиозните клетки в ярко синьо, ускорявайки интраоперативната оценка (Фигури 2в и г). При тези пациенти са направени общо 57 замразени секции, като 95% (54 от 57) са се съгласили с постоянни секции. Установено е, че трите отклонения са грешки в извадката.

дискусия

В исторически план оценката на подлигавичните нервни щамове и мускулните щамове и lamina propria нервни щамове са били от решаващо значение за потвърждаване на пациенти със съмнение за аганглиоза. Хистохимичното оцветяване с ацетилхолинестераза се използва широко като допълнение към идентифицирането и типизирането на парасимпатиковите нерви при ректални биопсии. Процесът, който изисква получаване на замразена тъкан, е потенциално токсичен и отнема много време. В допълнение, петна могат да бъдат трудни за тълкуване, особено в неясни случаи. 3, 4 Изискванията за интерпретация на това оцветяване са добре документирани с фалшиви положителни резултати, 4, 5, 6, 8, 9 фалшиви отрицателни резултати, 18, 19, 20, 21, 22 и неясни резултати от 19, 22.

Установихме, че използването на Diff Quik оцветяване върху замразена тъкан подчертава ганглиозните клетки чрез оцветяване на тяхната цитоплазма с ярко син цвят. Оцветяването е лесно достъпно, евтино и нетоксично и може да се прилага директно върху замразени тъканни участъци. Освен това не се изискват никакви технически познания. Контрастът между яркосиньото оцветяване в ганглиозните клетки и бледолилавото оцветяване в останалите тъкани улеснява бързата и лесна идентификация на ганглиозните клетки в интраоперативната среда. Когато се използват заедно с H- и E-оцветени пързалки, Diff Quik петна действат като допълнение, съкращавайки времето за интерпретация на замразените секции.

В заключение, задълбоченото изследване на няколко секции на H&E, свързани с адювантните имунохистохимични багрила перифералин и S-100, се оказа изключително чувствителен и специфичен начин за идентифициране на ганглиозни клетки при смукателни ректални биопсии. По време на проучването тази диагностична точност се поддържа при няколко нематогастинални и непедиатрични патолози. Този протокол подобри лабораторната ефективност, тъй като серийните секции на H&E бяха необходими в по-малко от 30% от случаите. Освен това не се изисква рутинно извличане на замразена тъкан. Всичко това беше постигнато при запазване на 24-часово време за изпълнение в 93% от случаите.