елементи
абстрактно
Фовалната хипоплазия, винаги придружена от нистагъм, се среща като част от клиничния спектър на различни очни нарушения, като аниридии, албинизъм и ахроматопсия. Все още не е известна молекулярната основа на изолирана автозомно-рецесивна фовална хипоплазия. Лица от очевидно несвързани израелски семейства от еврейски индиански произход (Мумбай) представиха изолирана фовеална хипоплазия, свързана с вроден нистагъм и намалена зрителна острота. Картографиране на хомозиготността в целия геном, последвано от фино картографиране, дефинира локус, свързан с болестта, от 830 Kb (LOD резултат 3, 5). Секвенирането в цели екзоми идентифицира една миссенс мутация в хомозиготния регион: c.95T> G, p (Ile32Ser) в консервираната аминокиселина в първия предсказан трансмембранен домен SLC38A8. Мутацията е напълно отделена от свързания със заболяването фенотип, което показва 10% процент на носител при евреите в Мумбай. SLC38A8 кодира предполагаем зависим от натрий аминокиселинен/протонен антипортер, за който сме доказали, че се експресира изключително в окото. По този начин хомозиготната мутация SLC38A8 вероятно е в основата на изолирана фовеална хипоплазия.
Фовеята, най-централната част на макулата, която позволява рязко зрение, е непрекъснат слой ганглиозни клетки с висока концентрация на конусни фоторецептори, който няма няколко вътрешни слоя на ретината, както и ретинална васкулатура. Фовеалната хипоплазия се определя като липса на фовална депресия с непрекъснатост на всички невросензорни ретинални слоеве в предполагаемата област на фовеята. Обикновено се описва във връзка с други очни нарушения като аниридия, микрофталмия, албинизъм и ахроматопсия. 2 Фовалната хипоплазия като изолиран обект е рядко явление, за което се съобщава в няколко случая до момента. 1, 2 Всички съобщени случаи на фовална хипоплазия са придружени от намалена зрителна острота и нистагъм. 1, 2 През последното десетилетие оптичната кохерентна томография (OCT) е предпочитана за откриване на фовална хипоплазия. 3
Съобщава се, че фовеалната хипоплазия е свързана с мутации в много гени, причиняващи спектър от очни нарушения. Доказано е, че 2 PAX6 мутации (MIM 607108) са в основата на изолирана фовеална хипоплазия, фовална хипоплазия и синдром на трансмисивна катаракта, както и фовална хипоплазия с аномалии на предния сегмент (MIM 136520). Фовозната хипоплазия е отличителен белег на различни видове околоутанен и очен албинизъм, като автозомно рецесивен очнокожен албинизъм тип IA (OCA1A (MIM 203100)) и очнокожен албинизъм тип IB (OCA1B (MIM 606952)) (който се причинява от TYR333333) и -обвързан очен албинизъм тип I (OA1 (MIM 300500)), който се причинява от мутации в GPR143 (MIM 300808). Друг X-асоцииран синдром на фовална хипоплазия е X-свързаната болест на Aland Island (AIED (MIM 300600)), причинена от мутации на CACNA1F (MIM 300110), която включва изразено зрително увреждане, нистагъм, късогледство, астигматизъм и протаново оцветяване.
Към днешна дата е доказано, че изолираната фовеална хипоплазия се причинява само като част от по-широк клиничен фенотипен спектър на PAX6 (автозомно доминираща) 4 и свързана с X мутация на GPR143. 5
пациенти и методи
пациенти
Бяха проучени девет засегнати лица (на възраст 1-65) от три на пръв поглед несвързани неродени израелски семейства от еврейски индианци (регион Мумбай) (Фигура 1а). След одобрение от медицински център на Сорока IRB и информирано съгласие, клиничният фенотип е определен от опитен офталмолог и генетик за всички засегнати лица, техните родители и братя и сестри. OCT се извършва, както е описано по-горе, като се използва Spectralis Tracking Laser Tomography (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany).
Семейства, фенотип и картографиране:( а ) Родословия на три засегнати очевидно несвързани семейства, които не са свързани с израелския еврейски Мумбай. Общият хомозиготен сегмент между chr16: 83885 и D16S2625 е дефиниран, микросателитните маркери и тяхното геномно положение (в Mb) са посочени вляво. ( б ) Спектралният домейн на OCT сканирането на задния полюс на дясното око на пациент II: 3 от родословие P1 спрямо нормален контролен субект. За разлика от контролния индивид (отгоре) с нормална фовеална ямка (стрелка), пациентът не показва структура на фовеята (отдолу). ( ° С ) Картографиране на автозиготност, показващо общ хомозиготен локус върху хромозома 16 при три засегнати индивиди от родословие P1 (II: 3, II: 4 и II: 5).
Изображение в пълен размер
Анализ на обвързването
Анализът на свързване в целия геном беше извършен с използване на Affymetrix GeneChip Human Mapping 500 K Set Nsp (Affymetrix, Санта Клара, Калифорния, САЩ), както е описано по-горе. Анализът на хомозиготността чрез спускане беше извършен с помощта на нашия генериран инструмент за картографиране на хомозиготност. 6 Извършено е фино картографиране и реконструкция на хаплотип за всички налични ДНК проби от трите родословни с помощта на полиморфни маркери, както е описано по-горе. Използваните 7 микросателитни маркера са както следва: D16S3098, D16S511, D16S534, D16S422, D16S3091, D16S402, chr16: 83613, chr16: 83885, chr16: 84282, D16S2625, D16S3061, D16S3037 и D16S539. Всички физически позиции са в съответствие със сглобката GRCh37/hg19. Многоточков LOD резултат за трите родословия в общия сайт беше изчислен с помощта на SUPERLINK (//bioinfo.cs.technion.ac.il/superlinkonline/), 8 приемайки автозомно-рецесивен режим на наследяване с проникване 0, 99 и честота на мутации на мутантни болести. 0,01.
последователност
Цялостното секвениране на екзома (HiSeq2000, Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ) се извършва с помощта на двоен (2 х 100) протокол при средно покритие 30 пъти (85-90% от всички екзонови нуклеотиди са покрити> 10, както е описано по-горе За обогатяване на екзомата използвахме библиотеката NimbleGen SeqCap EZ Human Exome v2.0 (Roche NimbleGen, Madison, WI, USA), насочена към региони с размери 44,1 Mb. Четене на последователност, извикване на варианти и анотиране бяха извършени от DNAnexus (DNAnexus Inc., Mountain View, Калифорния, САЩ; dnanexus.com).
Анализ на ограничения
Мутацията SLC38A8 c.95T> G премахва BtsCI рестрикционното място, позволявайки анализ на диференциална рестрикция, който осигурява 105 bp и 145 bp фрагменти за дивия тип последователност спрямо единичен фрагмент от 250 bp за мутантния вариант. PCR праймери: напред-5'-GGAGGAAAGCGTGAAGACTG-3 '; Обратен 5'-GGACTTACCAGCTCCACCAG-3 ′.
Анализ на експресията на SLC38A8
Панел от cDNA проби, извлечени (ABgene, Epson, UK) от РНК от различни тъкани на PBSX1 предварително конфузирани мишки C57BL/6, бяха анализирани с помощта на два комплекта PCR праймери за усилване на cDNA вместо геномна ДНК на мишка Slc38a8 и бета-2 ген за микрогулобулин ( B2m) като контрол. Праймери, използвани за усилване на Slc38a8 (320 bp ампликон): Напред 5-GGCTTTCCTCAGAGTGATCG-3 '; Обратен 5'-AGCAGATGGTAGGGAACACG-3 '; Грундове, използвани за B2m (98 bp ампликон): напред 5′-TGGTGCTTGTCTCACTGACC-3 '; Обратен 5'-TATGTTCGGCTTCCCATTCT-3 ′.
резултатът
Всички пациенти са имали нистагъм и субнормално зрение от детството. При два от тях се наблюдава периодичен редуващ се нистагъм със спонтанни промени в въртенето на главата. Зрителната острота на пациентите варира между 6/15 и 6/60. При всички пациенти са открити рефракционни грешки, вариращи между лека хиперметропия и висока миопия. Всички пациенти са имали астигматизъм. Шест пациенти са имали страбизъм. Всички пациенти са имали нормална пигментация на кожата и очите и липса на скрининг на ириса. Тест на очното дъно при всички пациенти показва фовална хипоплазия. Пациент II: 3 ОСТ (родословие P1) показва липса на нормална фовеална яма (Фигура 1b). Тестовото електролетинографско тестване и тестването на визуално предизвикания потенциал са в нормални граници при шест пациенти. Цветното зрение на четиримата пациенти, оценени от теста за цветно зрение Ishihara, е нормално. Трима пациенти в родословие P1 са имали леко забавяне в развитието и повсеместни нарушения в развитието. Един пациент от родословие 3 е имал захарен диабет и хипертония. Няма други системни отклонения.
Хомозиготността чрез анализ на спускането при всички индивиди от родословие на P1 идентифицира 3.4-Mb хомозиготен сегмент на хромозома 16q23.3-16q24.1 (Фигура 1в) между SNPs rs4888203 и rs6419428, което е често срещано при засегнатите пациенти от P1 родословие. Фино картографиране и реконструкция на хаплотип, извършено за всички налични ДНК проби от трите родословни, стеснява района на споделена хомозиготност до сегмент от 830 Kb между chr16: 83885 и D16S2625, поддържайки общ родов произход за този локус (Фигура 1а). Използвайки всички горепосочени маркери за микросателит, трите комбинирани родословия постигнаха максимални LOD резултати от 3,5 с Chr16: 84282.
Данните за последователността за цялата екзома на отделни P1 родословия II: 3 (Фигура 1а) бяха филтрирани за известни варианти (dbSNP база данни и Exome Variant Server, NHLBI Exome Sequencing Project, Сиатъл, Вашингтон, САЩ; достъп до декември 2011 г.). всеки от гените, свързани преди това с изолирана фовеална хипоплазия (няколко сегмента с покритие по-малко от X30 са секвенирани от Sanger; данните не са показани). В рамките на тесния локус от 830 kb е намерена само една мутация: мутация c.95T> G в екзон 1 на SLC38A8 (номер на присъединяване RefSeq NM_001080442.1), която е причинила предполагаемото заместване на p. (Ile32Ser) в зрял протеин (Фигура 2а). Мутацията SLC38A8 (достъпна на //databases.lovd.nl/shared/genes/SLC38A8), проверена чрез секвениране на Sanger, не е включена в проекта за 1000 генома (browser.1000genomes.org) и е в силно консервираната аминокиселина в предполагаемият първи трансмембранен домен на SLC38A8. (Фигури 2b, c). Анализът на рестрикцията на BtsCI показа, че мутацията SLC38A8 се сегрегира, както се очаква в засегнатите семейства. От 50 несвързани евреи с произход от Мумбай, 5 са показани като хетерозиготни носители на мутацията. Анализът на експресията на SLC38A8 в различни миши тъкани показа, че той се транскрибира изключително в окото (Фигура 2г).
SLC38A8 мутация и модел на експресия:( а ) Последователност на Sanger на незасегнат индивид (P1, II: 2), задължителен носител (P1, I: 2) и засегнат индивид (P1, II: 3). ( б ) SMART дисплей на човешкия трансмембранен домен SLC38A8, подчертаващ позицията на мутацията на P. (Ile32Ser). ( ° С ) Групиране на няколко ортологични последователности на SLC38A8. Засегнатите изолевцинови остатъци (опаковани в червено) се запазват във всички видове до зебра. ( д ) RT-PCR на различни нормални миши тъкани, демонстриращи Sc38a8 тъканна специфичност .
Изображение в пълен размер
дискусия
Обстоен клиничен анализ на нашите пациенти показа, че фенотипът е ограничен до изолирана фовална хипоплазия, вроден нистагъм и ниска зрителна острота, с вариабилност в очния фенотип при различни засегнати индивиди. Все още не е известна молекулярната основа на много случаи на изолиран нистагъм по света10, а диагностичните методи, използвани за диагностициране на фовална хипоплазия преди въвеждането на OCT, могат да пропуснат фините случаи. Фовалната хипоплазия със вторичен нистагъм, вероятно поради рецесивно наследяване, може да бъде по-често, отколкото обикновено се смята.
Inbred еврейската общност в региона на Конкан в Западна Индия, близо до Мумбай (бивш Мумбай), често се нарича "Бней Израел". Според неписания фолклор на тази общност те са потомци на бежанци от древен Израел (Самария) след асирийското завоевание (8 век пр. Н. Е.) Или по-късна еврейска група мигранти. Твърди се, че някои от техните предци са дошли на брега на Конкан в резултат на корабокрушението през 175 г. пр. Н. Е. Традицията казва, че само седем мъже и седем жени са оцелели. След 1750 г. техните потомци се преместват в Мумбай, а през 1947 г. много от тях се преместват в Израел. През цялата си добре позната история Бней Израел се е установил в малки общности и е останал самороден и изолиран от други евреи в тяхната близост (като евреите от Кочин и Калкута). Все още има малки общности в Израел с голямо разпространение на потомците на Bnei на Израел. 11 В тази изключително инбредна малка общност (изчислено е, че през 2000 г. в Израел е имало 35 000 израелски евреи), 11 фовеална хипоплазия е често срещана, в съответствие с високия процент на разпространение, който открихме.
Единствените доклади, идентифициращи молекулярната основа на изолирана фовална хипоплазия, са един случай на доминираща мутация на PAX6 missense като част от спектъра на аниридиите, 4 и китайското семейство с X-свързан нистагъм поради мутацията GPR143 (OA1), 5 където фовеална хипоплазията е вероятно да участва в лек очен албинизъм, пропорционален на експресията на GPR143, главно в пигментните клетки на кожата и очите. Нашите пациенти са различни по отношение на автозомно-рецесивното наследяване на фовална хипоплазия и нямат признаци на очно-кожен или очен албинизъм. Наличието на ахроматопсия или конична дистрофия също е изключено от нормалната електроретинограма и цветното зрение. По този начин анатомичното разстройство на фовеята, доказано от ОСТ, изглежда е единствената причина за тяхното зрително увреждане и нистагъм. Смята се, че идиопатичният детски нистагъм е основният дефект в частите на мозъка, отговорни за контрола на очния двигател. Тъй като експресията на SLC38A8 е ограничена до окото без експресия в мозъка, вероятно е нистагмът, причинен от мутацията на SLC38A8, да е вторичен за фовалната хипоплазия.