елементи
абстрактно
Аторвастатин е често използвано лекарство за понижаване на холестерола за лечение на хиперхолестеролемия. Той инхибира 3-хидрокси-3-метилглутарил-коензим А редуктаза (HMG-CoA), ензим, който катализира ограничаващата скоростта стъпка на синтеза на холестерол 11. Доколкото ни е известно, нито едно публикувано проучване не е свързано с промени в ГМ при лечение с аторвастатин в HFD-индуциран модел на хиперхолестеролемичен плъх. Нашата цел беше да определим как GM реагира на индуцирано от аторвастатин намаляване на нивата на холестерол в модел на HFD-индуциран хиперхолестеролемичен плъх. По-специално, ние се опитахме да определим дали лечението с лекарства може да повлияе на състава и разнообразието на ГМ при плъхове с хиперхолестеролемия в сравнение със здрави контроли.
резултатът
Анализ на хиперхолестеролемия и медикаментозно лечение
Хиперхолестеролемията е потвърдена след 5 седмици HFD хранене с повишени нива на серумен холестерол. Нива на холестерол (P 
Относително изобилие, изразено като процент от доминиращата и/или често присъстваща бактериална философия между различните диетични и лекарствени групи. Граничните точки за селекция на доминиращата фила бяха определени на> 1% и често присъстващите таксони бяха открити при> 50% от плъховете в групата. НИЗ, нормална диета; NCD-T, нормална диета + лечение с аторвастатин; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg аторвастатин; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg аторвастатин; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg аторвастатин; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg аторвастатин.
Изображение в пълен размер
Промяна в чревната микрофлора в отговор на HFD
Промяна на дозата в зависимост от таксоните в групата на аторвастатин в сравнение с контролите
Относителният брой на протеобактериите е значителен (P
Многоизмерна фундаментална координация на анализа на състава на микробните общности между различни групи. PCoA се извършва от последователности на ниво OTU с> 97% сходство, като се използва непретеглената метрика за разстояние UniFrac. НИЗ, нормална диета; NCD-T, нормална диета + лечение с аторвастатин; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg аторвастатин; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg аторвастатин; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg аторвастатин; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg аторвастатин.
Изображение в пълен размер
Алфа анализ на последователността на разнообразието звучи. ( A ) Редки криви на експериментално наблюдавано OTU спрямо ( Б. ), изчислено с помощта на Chao1. ( ° С ) Биоразнообразието, оценено от индекса на Шанън. НИЗ, нормална диета; NCD-T, нормална диета + лечение с аторвастатин; HFD, диета с високо съдържание на мазнини; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg аторвастатин; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg аторвастатин; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg аторвастатин; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg аторвастатин.
Изображение в пълен размер
Както при групите с HFD, относителното изобилие на щама Proteobacteria, семействата (Porphyromonadaceae, Desulfovibrionaceae и Helicobacteraceae) и рода Helicobacter се увеличава в групата с NCD-T в сравнение с контролната група за NCD. В допълнение Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Spirochaetaceae и Eubacteriaceae показват значително увеличение в групата с NCD-T в сравнение с контрола на NCD (Допълнителна таблица 2). По същия начин родовете Treponema, Lachnoclostridium, Barnesiella, Ruminococcus, Eubacterium, Desulfovibrio и Roseburia се увеличават в групата с NCD-T. Докато сред доминиращите родове, относителното изобилие на Oscillospira, Prevotella, Bacteroides и Parabacteroides е намалено в групата с NCD-T в сравнение с контрола на NCD (Допълнителна таблица 3).
Съотношения между половете и нивата на холестерола
Проведена е обща корелация с нивата на холестерола, като се използва непараметричният корелационен анализ на Spearman. Установено е, че доминиращите таксони, които са били променени в групите NCD-T, HFD, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg и 20 mg/kg, корелират с различни холестероли. Гените, които са били в отрицателна корелация с нивата на LDL (ρ> −0, 17), TG (ρ> −0, 14) и холестерола (ρ> −0, 27), включват Clostridium, Desulfovibrio, Roseburia, Blautia, Helicobacter, Ruminococcus и Лактобацилус (фиг. 5). ). Установено е обаче, че Prevotella, Coprococcus, Prevotella [YRC22], Paraprevotella, Clostridia [SMB53] и Dorea имат положителна корелация с LDL (ρ> 0, 2), TG (ρ> 0, 1) и холестерола (ρ> 0) нива., 26) (фиг. 5). По същия начин Oscillospira (ρ> 0, 33) показва положителна корелация с нивата на HDL (фиг. 5).
Като цяло намаленото относително изобилие от Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Rikenellaceae, Peptostreptococcaceae и Lachnospiraceae се наблюдава при различни дози лечение с аторвастатин в групата с HFD. Wang et al. съобщава за намалени нива на Clostridiaceae след прилагане на пробиотични бактериални щамове (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium animalis) на мишки, хранени с HFD 28. По същия начин, прилагането на неферментираща влакнеста хидроксипропилметилцелулоза на мишки, хранени с HFD, или преминаване към диета с ниско съдържание на мазнини намалява честотата на Lachnospiraceae 29. За разлика от това, в групите, лекувани с наркотици, се наблюдава повишена честота на Porphyromonadaceae, Ruminococcaceae и Desulfovibrionaceae. Прилагането на Lactobacillus paracasei на апо-Е -/- мишки значително намалява нивата на холестерола и увеличава разпространението на Porphyromonadaceae във фекалиите 30. Допълнените с капсаицин HFD мишки са имали повишена честота на Ruminococcaceae 31. По същия начин, диета с високо съдържание на мазнини/холестерол, допълнена с Lactobacillus reuteri active Lactobacillus reuteri active Lactobacillus reuteri, активна за жлъчните соли, увеличава количеството на Desulfovibrionaceae 25 .
Лечението с аторвастатин в групата с HFD повишава относителната честота на Bacteroides и Parabacteroides. Бактероидите и парабактероидите имат максимално количество при 10 mg/kg и 15 mg/kg. По същия начин, прилагането на лизони на HFD-захранени апоЕ -/- мишки повишава нивата на Bacteroides и Parabacteroides заедно с намаляващите нива на TG32. Бактероидите са свързани с метаболизма на жлъчните киселини и насърчават деконюгацията на конюгирана с таурин жлъчна киселина, присъстваща в серума 18, 33. Диета с висок холестерол/холева киселина модифицира състава на фекалната жлъчна киселина 34 и променената жлъчна киселина се свързва с дисбиоза 35. Нивото на Desulfovibrio (бактерии, произвеждащи ендотоксин и редуциращи сулфат бактерии) 36, 37 показва повишено относително изобилие в групата с NCD-T.
По същия начин родът Parabacteroides, който съдържа противовъзпалителни бактерии 38, показва постоянно нарастване на относителното изобилие при различни дози аторвастатин в групата с HFD. Руминококи (бактерии, произвеждащи триптамин) 39 показват потиснати нива на лечение с аторвастатин при плъхове, хранени с HFD. Родът Oscillospira, който включва видове 40, произвеждащи бутират, показва постоянно нарастване в групата на HFD, лекувани с лекарства. Лечението с рапамицин (регулатор на потреблението и съхранението на енергия) при плъхове, индуцирани от затлъстяване с HFD, води до повишени нива на Turicibacter 41. В нашето проучване открихме намалено ниво на Turicibacter в групите с HFD, лекувани с лекарството. По същия начин Clostridium (произвеждащи бутират таксони) 42 показва намалени нива в групата, лекувана с наркотици. В съответствие с нашите открития, Di Lucci et. ал. съобщава за повишена честота на Coprococcus при богат на фруктоза метаболитен синдром при модел на затлъстели плъхове 43 .
Catry et al. съобщава за повишени нива на Lactobacillus видове след приложение на езетимиб и симвастатин при мишки, хранени с NCD 7. В групата с NCD-T наблюдаваме повишена относителна честота на Lactobacillus. Способността на бактериите за понижаване на холестерола на Lactobacillus вече е демонстрирана чрез прилагане на Lactobacillus reuteri LR6, Lactobacillus reuteri NCIMB 30242 и Lactobacillus johnsonii BS15 при плъхове и пациенти с хиперхолестеролемия и в миши модел на безалкохолно мастно заболяване. определят точната му роля в метаболизма на холестерола. По време на лечението с аторвастатин, ние се опитахме да свържем нивата на холестерола при плъхове с относителния брой на потенциалните холестерол-понижаващи бактерии. Ограничението на нашето проучване беше липсата на метаболомични данни. Използването на този инструмент може да осигури подробна връзка между състава на серумните метаболити и микробиома по отношение на лечението с аторвастатин.
Като цяло това проучване показва ефекта на аторвастатин върху генетично модифицирания животински модел на HFD. По-специално, приложението на аторвастатин увеличава бактериалното разнообразие и връща относителния брой на няколко доминиращи таксона, които са променени от HFD към фенотипа на NCD. Лечението с аторвастатин също е причинило специфичен ефект на лекарството върху разпределението на популацията на определени бактерии в групите за лечение с HFD и NCD-T. Различните класове лекарства за понижаване на холестерола могат да причинят различни ефекти върху чревния микробиол и да осигурят потенциална връзка между ГМ състава, нивата на холестерола и лечението с лекарства. В заключение, лекарствата за понижаване на холестерола, които обикновено се предписват по време на хиперхолестеролемия, трябва да бъдат анализирани за модифициращи микробиома ефекти, които могат да имат значителен ефект върху здравето на гостоприемника.
Материал и реактиви
Животински модел и лечение
Четиридесет и два безпатогенни плъха Wistar (100-120 g) бяха осигурени от Катедрата по биохимия, Университет Крал Абдулазиз, Джеда, Саудитска Арабия. HFD съдържа 3% холестерол (Sigma Aldrich Co., САЩ), 0.2% холева киселина (Sigma Aldrich Co., USA), 15% говежди лой и 81.8% нормални фуражи. Всички добавени съставки са взети като процент от общата диета. Аторвастатин (Pfizer Inc., САЩ) се използва като лекарство за понижаване на холестерола. Всички експерименти с животни в това проучване са извършени върху животни от съоръженията на Катедрата по биохимия, Факултет по наука, Университет Крал Абдулазиз. Протоколът за изследване е одобрен от Комисията за изследване на етиката на Медицинския факултет на Университета Крал Абдулазиз под номера на споразумението (Регистрационен номер HA-02-J-008). Експериментът е извършен в съответствие с одобрените насоки.
Плъховете бяха аклиматизирани към стандартизирани параметри на околната среда на животните за 7 дни, включително температура (21 ± 1 ° C), относителна влажност (60 ± 10%) и 12-часов цикъл ден-нощ. Околните условия за животните се поддържат до края на експеримента. Първоначално 42 плъха бяха разделени на случаен принцип в две групи и хранени с нормална диета (NCD; n = 12) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD; n = 30). Хиперхолестеролемията е потвърдена след 5 седмици лечение с HFD. От групата с NCD, шест плъха са третирани с 10 mg/kg/d аторвастатин (NCD-T), докато останалите шест плъха са поддържани като NCD контроли. В HFD-индуцираната хиперхолестеролемична група, шест плъха служат за контрол на HFD, а останалите 24 плъха се разделят на четири равни групи и се третират с различни концентрации на аторвастатин (5, 10, 15 или 20 mg/kg/ден). Аторвастатин се суспендира в изчислено количество стерилна дестилирана вода с помощта на магнитна бъркалка и лекарството се прилага интрагастрално веднъж на всеки 24 часа, като се използва сонда 47. Животните са лекувани с аторвастатин в продължение на 28 дни.
Вземане на проби от кръв и тъкани и анализ на нивата на холестерола
Взети са кръвни проби от орбиталния сплит в два времеви момента: след 5 седмици за потвърждаване на хиперхолестеролемия в групата с HFD и преди клане, за да се оцени ефектът от лекарственото лечение върху нивата на холестерола в изследваните групи. Серумите се изолират от кръвни проби чрез центрофугиране при 3000 rpm при 4 ° С за 15 минути. Липидните профили, включително серумен LDL, холестерол, TG и HDL, бяха тествани с помощта на автоматичен биохимичен анализатор (Aeroset 09D0501, американски). Съдържанието на цекалите се събира от всички животни веднага след клането и се съхранява при -80 ° C за изолиране на ДНК.
16S rRNA секвениране и обработка на данни
Метагеномната ДНК беше извлечена от цекалното съдържание с помощта на комплект за екстракция на ДНК AccuVisBio (AccuVisBio, Абу Даби) в съответствие с инструкциите на производителя и концентрацията на ДНК беше измерена с помощта на система Qubit (Invitrogen, САЩ). Пробите бяха секвенирани за 16 S rRNA гени, насочени към V3-V4 региона, използвайки баркодове от 341 F и 785 R универсални праймери, съгласно процедурата на Dowda et al. 48. Използвани са двойни индексни баркодове и адаптери за последователност Illumina за свързване на четците чрез ограничен PCR цикъл. След пречистване с топчета Agencourt AMPure (Agencourt, САЩ), библиотеките бяха нормализирани, използвайки протокола Nextera XT. Пробите бяха събрани в единична поточна клетка за секвениране на платформа за секвениране MiSeq (Illumina, Сан Диего) съгласно протокола на производителя. Автоматизираното генериране на клъстери и последователното сдвояване с двойно индексиране бяха извършени в един цикъл с дължина на четене 2 x 300 bp.
Сдвоените крайни показания бяха събрани с помощта на PANDAseq и Raw FASTQ файлове бяха получени от Illumina MiSeq 49 Грундовете и баркодовете бяха премахнати от последователностите. Всички читатели с „N“ и тези с последователност от 50. След това пречистените последователности бяха групирани при k = 10 (97% сходство), последвано от изтриване на химерите и сингълтонът чете 51,52. И накрая, OTU бяха класифицирани с помощта на QIIME 1.9 спрямо лечебна база данни, получена от GreenGenes 53. Данните за последователността от това проучване са достъпни в Европейския нуклеотиден архив по проект №. PRJEB23060.
Статистически анализ
Биоразнообразието и богатството на OTU бяха изчислени с помощта на QIIME 1.9, реализиран с непараметричен анализ Chao1 и анализ на разреждане, който показа еднородност и разпределение на OTU в различни групи. Данните бяха нормализирани до същия брой отчитания на проба и PCoA беше извършен от последователности на ниво OTU с> 97% сходство, използвайки непретеглената метрика за разстояние UniFrac. Графиката PCOA е визуализирана от EMPEROR. Бяха извършени еднопосочни ANOVA (за параметрични данни) и непараметрични тестове на Крускал-Уолис и Ман-Уитни (за нестандартни данни), за да се идентифицират значително различни бактериални таксони между различните групи, докато тестът Колмогоров-Смирнов D беше използван за определят нормалност. данни. За статистически анализ се използва SPSS версия 16. Различията в нивата на холестерола между контролната група и лекуваните групи бяха анализирани чрез t-тест на Student (двустранен) с помощта на GraphPad Prism версия 6.01 (Graph Pad Software, Сан Диего, САЩ) и значителните разлики бяха обозначени като * P