сигнализира

  • абстрактно
  • Основното
  • резултатът
  • Липсата на кислород предизвиква обработка на LC3
  • Хипоксията индуцира образуването на автофагозоми
  • Индуцираната от хипоксия автофогия на туморни клетки е независима от HIF-1 и неговите целеви генни продукти BNIP3 и BNIP3L
  • Активността на AMPK насърчава индуцирана от хипоксия автофагия
  • ATG5 е от съществено значение за индуцирана от хипоксия автофагия
  • MEF с дефицит на автофаги са по-туморогенни in vivo
  • дискусия
  • Материали и методи
  • Клетъчни линии и химикали
  • плазмиди
  • Уестърн блотинг
  • имунофлуоресценция
  • AO оцветяване
  • Измервания на разхода на кислород
  • Поглъщане на 2DG
  • Трансмисионна електронна микроскопия
  • Допълнителна информация
  • Word документи
  • Допълнителни изображения
  • Допълнителни легенди за изображения
  • Терминологичен речник

абстрактно

Основното

Ниският кислороден стрес е често срещана характеристика на няколко патофизиологични състояния, включително рак. Хипоксията при солидни тумори е свързана с резистентност към лъчетерапия и лоша прогноза. 1 Една от последиците от туморната хипоксия може да бъде клетъчната смърт. 2, 3 Обаче няколко групи са показали, че туморните клетки обикновено са добре адаптирани към лека хипоксия, при условие че не възникват допълнителни стресове, като лишаване от глюкоза. Екстремната хипоксия обаче е в състояние да активира апоптозата чрез зависим от хипоксия фактор-1 (HIF-1) процес. 4, 5, 6 Интересното е, че принудителната нормоксична експресия на целевия ген BNIF3 HIF-1 (Bcl-2 аденовирус E1a, деветнадесет килодалтон взаимодействащ протеин 3) причинява митохондриална дисфункция и клетъчна смърт в някои, но не всички експериментални условия. 5, 7, 8 Последните проучвания също са замесени в BNIP3 в керамид и индуцирана от арсен автофагия 9, 10 и в модел на исхемия/реперфузия на клетъчна смърт. 11.

5'-AMP-активираната протеин киназа (AMPK) е основен регулатор на енергийната хомеостаза. 12 Повишаването на съотношението AMP/ATP води до активиране на AMPK, който от своя страна подпомага енергийно произвеждащите катаболни процеси и облекчава енергоемките анаболни процеси. 13 Един от основните пътища надолу по веригата за този ефект е комплексът от туберкулозна склероза (TSC) и целта на рапамицин (mTOR) при бозайниците. Хипоксията е силен стимул на AMPK, който е независим от HIF активността и може да възникне, преди да има забележимо намаляване на вътреклетъчните нива на ATP. 15, 16 Последните доклади предполагат, че в допълнение към ролята на AMPK в регулирането на нормалния гликолитичен и окислителен метаболизъм, той може също да регулира хомеостазата на клетъчната енергия чрез автофагично рециклиране на вътреклетъчните компоненти. 17, 18

Макроавтофагията (наричана по-нататък автофагия) е катаболен процес, включващ регулираното храносмилане на клетъчните макромолекули и дори цели органели. 19 По време на автофаг, част от цитоплазмата се секвестира в двумембранни везикули, наречени автофагозоми, които след това се сливат с вакуоли или лизозоми, където се получава хидролиза на съдържанието или товара. 20 Автофагията за първи път е идентифицирана в дрождите като механизъм за оцеляване, когато хранителните вещества са намалени. 21 По-късно е установено, че автофагията е от съществено значение за различни физиологични процеси в метазоаните, като развитието на плодородни тела в Dictyostelium discoideum, ключови процеси в растителния метаболизъм, образуване на оцветяване при Caenorhabditis elegans и за ембрионалното развитие и неонаталното оцеляване при бозайниците.

Документирана е появата на автофаги в солидни тумори; Не е ясно обаче как този процес допринася за туморната биология. Beclin-1, хомолог на бозайник на гена за аутофагия на дрождите ATG6, е хаплоин-достатъчен туморен супресор. Установено е, че хетерозиготната делеция на гена BECN1 намалява автофагията, увеличава честотата на спонтанни злокачествени заболявания и ускорява развитието на HBV-индуцирана неоплазия. 23 Ектопичната реекспресия на беклин-1 в човешки ракови клетки на гърдата увеличава автофагията и намалява туморогенността. Доказано е също, че автофагията предпазва клетките на бозайници от метаболитен стрес: например в IL-3-зависими хематопоетични клетки и в обезсмъртени бъбречни и млечни епителни клетки. 26, 27, 28 Съществуват обаче и доказателства, че автофагията може да потисне туморогенността чрез иницииране на тип програмирана клетъчна смърт. 29, 30

Сигналните каскади, които се сближават и активират автофагичните механизми в туморните клетки, са слабо разбрани. В това проучване показахме, че хипоксията е в състояние да активира автофагията дори в присъствието на хранителни вещества и растежни фактори в клетки, способни на апоптоза. В допълнение, този автофагичен отговор е независим от HIF сигнализирането, изисква експресия на ATG5 и се насърчава от активността на AMPK. Ембрионалните фибробласти на мишки с дефицит на автофаг (MEF) показват намалена митохондриална активност, повишено усвояване на глюкоза и малко по-бърз растеж in vivo. Предполагаме, че тези метаболитни свойства на клетките с дефицит на автофаги допринасят за повишената им туморогенност.

резултатът

Липсата на кислород предизвиква обработка на LC3

Производство на AVO при аноксия. а ) Представителни графики на оцветени с AO проби SiHa. Клетките се инкубират в 21 или ** Р

За да разширим този анализ до BNIP3 и BNIP3L, използвахме RKO клетки, за да извършим пълна загуба на функционален анализ. В тази автофагично компетентна клетъчна линия без експресия на BNIP3, нокдаунът на BNIP3L би създал клетъчна линия с дефицит и на двата тези тясно свързани протеини. За тази цел RKO клетките бяха стабилно трансфектирани с shRNA, насочена срещу глупости (контрол) или BNIP3L. Колониите на резистентни към лекарства клонинги се обединяват и остават нелекувани или изложени на хипоксия за 24 часа. Добавени са инхибитори на катепсин, за да се разкрият фините разлики в оборота на LC3. Екстракти бяха събрани за уестърн блот (Фигура 3в). Установихме, че RKO клетките с shBNIP3L имат 90% намалена експресия на BNIP3L в допълнение към експресията на BNIP3. След това тези комплекти бяха тествани и показаха добро производство на AVO. Нито изразът BNIP3, нито BNIP3L е необходим (или достатъчен) за активиране на автофаги в отговор на хипоксия (Фигура 3в, среден панел).

Ние предположихме, че възобновяването на експресията на BNIP3 в тази конкретна клетъчна линия може да промени неговия метаболитен отговор на хипоксия чрез промяна в митохондриалния брой/функция. Анализът на клетките, свръхекспресиращи BNIP3 или BNIP3L нокдаун клетки за консумация на митохондриален кислород, разкрива, че при PDK1-медиирана хипоксия, няма разлика в докладваното по-рано намаляване на митохондриалната активност (Фигура 3в, десен панел). 37

Последните доклади предполагат, че ендоплазменият стрес в ретикулума (ER стрес; деградиран протеинов отговор (UPR)) може да активира автофагията. 38 Тежката липса на кислород е основен стимул за UPR; следователно ние изследвахме дали затихването на този процес може да повлияе на индуцирана от хипоксия автофагия. MeFalized MEF от див тип, ir-1 и -/- и PERK -/- бяха изложени на хипоксия за 24 или 48 часа, което е достатъчно за предизвикване на ER/UPR. 39 LC3 обработка е открита във всички проби, независимо от техния статус Ireland-1 a и PERK (Допълнителна фигура S3). Този резултат предполага, че автофагията, предизвикана от тежка хипоксия, не зависи от пълната реакция на стрес към UPR.

Активността на AMPK насърчава индуцирана от хипоксия автофагия

AMPK е основният регулатор на енергийната хомеостаза. 12 Активира се от много стресове, включително хипоксия. Следователно, ние изследвахме потенциалната роля на AMPK в индуцираната от хипоксия автофагия, използвайки обезсмъртени MEFs, получени или от див тип, или AMPK α1 и α2 нокаут ембриони. А-субединиците, които осигуряват AMPK каталитична активност, отсъстваха в тези нокаутиращи клетъчни линии, както се определя чрез Western blotting (Фигура 4а). Както се очаква, зависимо от дозата активиране на AMPK пътя и фосфорилиране на ацетил-CoA карбоксилаза при хипоксичен стрес се случи само при MEF от див тип (Фигура 4а). Инкубацията на клетки от див тип в EBSS в продължение на 3 часа също причинява леко фосфорилиране на ACC1/2. Излагане на клетки от див тип 0, 5 или

За да определим дали тези процеси, които се регулират от ATG5, са имали клетъчно въздействие, тествахме клетки от див тип и нокаутирали клетки ATG5 за ефективност на полагане при умерена или тежка хипоксия. Едноклетъчните суспензии се посяват и отглеждат в продължение на 10 дни в 2 или 0,5% кислород и се преброяват оцелелите колонии. Клетките от див тип показаха значително намаляване на ефективността на покритието при хипоксия в сравнение с нокаут клетките (Фигура 5в, ляв панел). За да се тества реакцията на тежка хипоксия, едноклетъчни суспензии се поставят върху плаки и се излагат на кислород.

Загубата на ATG5 леко увеличава растежа на моделни тумори. а ) Обезсмъртените нокаути от див тип (WT) MEF и ATG5 (KO) бяха трансформирани с Ras и инжектирани подкожно във фланговете на женски голи мишки. Размерът на тумора се измерва на всеки 3 дни с помощта на шублери. ( б ) Ras-трансформирани MEF криви на растеж на тумора, при които експресията на ATG5 е потисната от доксициклин. Към питейната вода се добавя доксициклин. ° С ) In vivo LC3 обработката изисква ATG5. Туморите на тези генотипове бяха изолирани и прясно приготвени протеинови лизати бяха използвани за имунодетекция на ATG5 и LC3. Свързана с мембрана форма на LC3 (счупени стрелки) се открива само в експресиращи ATG5 туморни лизати.

Изображение в пълен размер

дискусия

Все по-голям списък от (pat) -физиологични условия и химични съединения е известен със способността си да активира автофагията. Генетичните подходи помогнаха да се оцени значението на автофагичния апарат по време на нормалното развитие и предизвикаха интерес към биологичните последици от дерегулацията му при заболявания, включително рак. Хипоксията, недостигът на хранителни вещества и изчерпването на растежния фактор представляват стрес в туморната микросреда, който може ефективно да активира автофагията. Нашите резултати показват, че лишаването от кислород може да предизвика автофагия в човешките туморни клетки при липса на допълнителен стрес, като лишаване от глюкоза или отнемане на серума.

Нашите резултати разкриват положителна роля за AMPK сигналния път при индуцирането на автофагия при хипоксия. Има все повече доказателства в подкрепа на запазената роля на AMPK в автофагията, предизвикана от други стимули, като влизане в стационарна фаза в дрождите и лечение с р53-активиращи или Ca 2+ -мобилизиращи агенти. Известно е, че активирането на AMPK се случва след излагане на хипоксия, независимо от HIF. 15, 16 Освен това констатацията, че нулевите MEF на TSC2 също са устойчиви на индуцирана от хипоксия автофагия, предполага, че AMPK работи над TSC2 и чрез mTOR при регулиране на процеса. 41 Фактът, че AMPK α нулизиготни MEFs не са били напълно устойчиви на автофагия, увеличава възможността за сближаване на допълнителни пътища в основната автофагична машина.

Материали и методи

Клетъчни линии и химикали

Нокаутът на HIF-1 α и съответстващите MEF, обезсмъртени от див тип SV40, бяха подарък от R Johnson (Калифорнийски университет, Сан Диего). 44 номинални MEF на AMPK са описани другаде. 15 TSC2 +/+ p53 -/- и TSC2 -/- p53 -/- увековечени MEFs бяха подарък от DJ Kwiatkowski (Харвард, Бостън). SiHa цервикални и RKO клетки на дебелото черво са закупени от ATCC. Бъбречно ясен клетъчен карцином 786-0 и 786-0/VHL клетки са подарък от A Giaccia (Stanford University). Клетъчните клонове на HeLa, свръхекспресиращи BH3 протеини, са описани другаде. 5 нокаут клетки Ire-1 и PERK бяха подарък от A Koong (Станфордския университет). ATK5 нокаут, индуцируеми ATG5 MEFs и LC3 антитела бяха любезният подарък на N Mizushima (Токийски медицински и дентален университет). Всички клетъчни линии се отглеждат в DMEM с 10% фетален говежди серум и 20 mM HEPES. Туморогенните клонинги са получени от обезсмъртени ATG5 див тип и нокаут MEFs чрез стабилна трансфекция с онкогенен Ha-ras-кодиращ експресионен плазмид.

За лечение на хипоксия, клетките се инкубират в овлажнена хипоксична работна станция (Invivo 2, Ruskinn Inc., Cincinnati, OH, USA) или анаеробна работна станция с паладиев катализатор (Sheldon Corp., Cornelius, OR, USA). Крайните концентрации на кислород бяха потвърдени с помощта на полярографски електрод от тип Кларк (Animas, Frazer, PA, USA). В експерименти, включващи инхибиране на лизозомно разграждане, клетките, поставени в 12-ямкови културални плочи, се инкубират в 21 или 5, 37

Уестърн блотинг

Клетките се лизират в RIPA буфер, ултразвук и концентрации на протеин, изчислени чрез BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Протеините (10–20 μ g) се разделят в гелове Tris-Tricine и се прехвърлят върху мембрани Hybond-P (Amersham, Piscataway, NJ, USA). Използваните антитела са миши анти-HIF-1 α (BD Transduction Laboratories, Сан Диего, Калифорния, САЩ), анти-LC3 заешки поликлонал (MBL International, Woburn, MA, USA), миши анти-беклин-1 (BD Transduction Laboratories ), миши анти-ATG5 (Abnova), пилешки анти-ATG5 (Abcam, Кеймбридж, Масачузетс, САЩ), миши антитубулин (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния, САЩ), заешки анти-Glut1 (Neomarkers, Freemont, Калифорния, САЩ), миши анти-GAPDH (Research Diagnostics, Concord, MA, USA) и кози анти-LDH A (Santa Cruz Biotechnology). Заешки анти-AMPK, анти-АСС и анти-фосфо-АСС антитела са закупени от Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Заешките поликлонални антитела срещу BNIP3 и BNIP3L са описани другаде. 5 Вторичните конюгирани с алкална фосфатаза антитела са от Vector Laboratories Inc. (Бърлингейм, Калифорния, САЩ). Сигналите за имуноблотинг се визуализират с ECF субстрат (Amersham) и се откриват с помощта на Storm Imager (Molecular Dynamics, Сънивейл, Калифорния, САЩ).

имунофлуоресценция

Клетките, поставени в осемкамерни предметни стъкла (Nunc), бяха трансфектирани с GFP-LC3 експресионен плазмид, използвайки Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Клетките се фиксират с 4% параформалдехид и ядрата се оцветяват с 10 μg/ml Hoechst 33342. Клетките се визуализират на микроскоп Nikon Eclipse E800, оборудван с CCD цифров фотоапарат Spot RT Slider (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, USA).

AO оцветяване

Промените във вътреклетъчните кисели отделения бяха определени съгласно Klionsky 20 с незначителни модификации. Накратко, след третирането, клетките бяха оцветени с 2,5 μg/ml AO за 15 минути, трипсинизирани, ресуспендирани в PBS и незабавно анализирани в FACSCalibur поточен цитометър (Becton Dickinson, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Зелената и червената флуоресценции бяха измерени в линейна скала, използвайки съответно каналите FL1 и FL3.

Измервания на разхода на кислород

Клетките, поставени в 100-милиметрови плаки за тъканна култура, се инкубират при 0,5 или 6 клетки/ml и консумацията на кислород се измерва с помощта на електроден блок Oxytherm (Hansatech, Norfolk, UK).

Поглъщане на 2DG

2- [1,2,3-Н (N)] - Дезокси-D-глюкозата е закупена от PerkinElmer (Бостън, МА, САЩ). Клетките в шест ямкови плаки се инкубират при 37 ° С под 21% или се добавя 3H-белязан 2DG за допълнителни 30 минути. След това клетките се измиват два пъти със студен PBS и се лизират с 0.2 М NaOH/0.1% SDS. Радиоактивността се измерва с течен сцинтилационен брояч. Идентични серии от проби бяха лизирани в RIPA буфер за измерване на протеиновите концентрации.

Трансмисионна електронна микроскопия

Клетъчните монослоеве бяха фиксирани в 2% глутаралдехиден буфер. Срезите бяха оцветени с уранилацетат и оловен цитрат и изследвани с електронен микроскоп на Jeoll230.