елементи

абстрактно

Класическата галактоземия е наследствено рецесивно разстройство на метаболизма на галактоза, причинено от дефицит на ензима галактоза-1-фосфат уридилтрансфераза (GALT), който се причинява от мутации в гена GALT. В това проучване 56 турски пациенти, диагностицирани с галактоземия, са били скринирани за GALT генни мутации, използвайки микрочипове на Affymetrix последователност. При тези пациенти са идентифицирани 11 вида мутации, включително две нови мутации (R258G и G310fsX49) и девет повтарящи се мутации. В това проучване идентифицирахме шест пациенти, които бяха хомозиготни за мутацията E340 * и за тихи замествания N314D, L218L (вариант Duarte-1). Хаплотипите E340 *, N314D и L218L са докладвани само при турски пациенти, което предполага, че мутацията E340 * е специфична за нашето население и може да се разпространи от турския предшественик. Алер Duarte-1 е открит при пациенти с честота 10,71%, докато алелът Duarte-2 не е открит. Установено е, че алелите Duarte-1 и Duarte-2 присъстват с честота 2,3% и 1,4% при скрининга на 105 здрави индивида. С оглед на всички намерени мутации е много важно да се установи, че екзони 6 и 10 от гена GALT представляват 79% от всички мутантни алели в турската популация. Най-честата мутация е Q188R с честота 55, 35%.

галактоземия

Галактоземията е автозомно-рецесивно нарушение на метаболизма на галактозата, резултат от недостатъчна или липсваща активност на галактокиназа, галактоза-1-фосфат-уридилтрансфераза (GALT) и ензимите UDP-галактоза-4'-епимераза, които играят роля в метаболизма на галактозата в Лелойра. Преобладаващата форма е галактоземия от класически тип, която се причинява от силно намаляване или отсъствие на ензима GALT и има честота от 1/40 000-60 000 при новородени в Европа. Съобщени са повече от 150 мутации в гена GALT. 3

Намалената активност на GALT ензима води до натрупване на gal-1P в различни органи. Болестта обикновено се появява през първите дни от живота след поглъщане на кърма или продукта. Най-ранните клинични находки на заболяването са повръщане, диария, невъзможност за процъфтяване и жълтеница. Въпреки че много от тези симптоми изчезват с диета с ограничена галактоза, дългосрочните усложнения като умствена изостаналост, нарушения на говора или обучението и преждевременна яйчникова недостатъчност при пациенти от женски пол все още могат да продължат. 4

Галактоземия тип I се класифицира в тежки класически и леки фенотипи на Duarte въз основа на остатъчна активност на GALT. Класическата галактоземия често се свързва с мутации S135L, Q188R и K285N в гена GALT. Функционално неутралната промяна на N314D в гена GALT е свързана с галактоземия на Duarte и е широко разпространена сред популациите по целия свят. Вариантът Duarte-1 има нормална или повишена GALT ензимна активност, докато вариантът Duarte-2 има ниска GALT ензимна активност. Алерът на Duarte-1 е свързан с мутацията N314D при свързване на неравновесие с полиморфизма L218L. Алерът на Duarte-2 е свързан с мутацията N314D при свързване на неравновесие с три интронални полиморфизма IVS4nt-27 g-> c, IVS5nt-24 g-> aa IVS5nt + 62 g-> a и заличаване на c-119 -> - 116delGTCA в 5 'непреведени области. 6, 7 Типът Duarte-1 не причинява никакви клинични или биохимични аномалии, тъй като полиморфизмът L218L увеличава скоростта на транслация на протеина N314D GALT. 5 Делецията на 5'-нетранслирания регион-119 -> - 116delGTCA в промоторния регион на гена GALT (вариант Duarte-2) води до намаляване на транскрипцията на ген GALT. 8

В този доклад ние съобщаваме за генни мутации на GALT в 56 случая на галактоземия от Турция, идентифицирани чрез ресеквениране на ДНК микрочипове. Освен това 105 здрави индивида бяха тествани, за да се определи честотата на алелните варианти на Duarte-1 и Duarte-2 в турската популация.

Материали и методи

пациенти

Петдесет и шест турски пациенти с галактоземия в Университета Хачеттепе, катедра по педиатрия, Отдел за метаболизъм, бяха включени в проучване за откриване на мутации в гена GALT, използвайки методология на микрочиповата последователност. Писмено информирано съгласие беше получено от всички участващи страни. Пациентите с класическа галактоземия са имали типични симптоми като неуспех, повръщане, хепатоспленомегалия и чернодробна недостатъчност. Диагнозата галактоземия се подозира чрез намирането на редуциращ агент, който не реагира с реагентите на глюкозооксидазата и хартиената хроматографска идентификация на захарта.

ДНК изолация и PCR

Геномната ДНК се изолира от периферната кръв чрез утаяване на амониев ацетат. Генът GALT беше амплифициран като два фрагмента чрез PCR на далечни разстояния, като се използваха праймери на фрагмент-1F5'-CACGGCCCTGCAGATTTTCC-3 ', фрагмент-1R5'-CTTCATCACCCCCTCCCTGC-3' (дължина на продукта на PCR 1348 bp) и фрагмент-2F5'-CTCCA 'GCG, фрагмент-2R5'-AGTTGTAGCTGGAGCTATGC-3 '(PCR дължина на продукта 2878 bp). Всички праймери са проектирани с помощта на софтуер за анализ на праймери Oligo (Oligo Version 6.71, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, USA). PCR реакциите се провеждат в продължение на 32 цикъла, като всеки цикъл се състои от денатурация при 94 ° C за 10 s, отгряване при 60 ° C за 30 s и удължаване при 68 ° C за минимум 5 минути, с окончателно удължаване при 68 ° С. за 15 минути.

Мутационен скрининг

резултатът

В това проучване ние докладваме мутационен анализ в гена GALT, принадлежащ на 56 пациенти, представени от клинични находки за класическа галактоземия и тип Duarte-1. Нуклеотидни замествания в гена GALT бяха открити с помощта на последователни микрочипове, с изключение на делеция или вмъкване на нуклеотидни промени. Вмъкване/делеция на мутации бяха открити с помощта на директно секвениране на ДНК. Мутационният скрининг идентифицира 109 от 112 мутантни алела в гена GALT. При тези пациенти са открити 11 вида мутации, включително девет повтарящи се мутации (c.425T> C; M142K, c.536G> A; G179D, c.563A> G; Q188R, c.692G> A; R231H, c.855G > T, K285N, c.881T> A, F294Y, c.958G> A, A320T, c.983G> A a; R328H, c.940A> G; E340 *) и две нови мутации (c.772C> G; А); R258G и c.928delG; G310fsX49). Новата мутация G310fsX49 беше открита, използвайки директно ДНК секвениране спрямо други мутации.

Четиридесет и девет пациенти са хомозиготни, а четирима пациенти са с хетерозиготна мутация. При трима пациенти е идентифициран само един мутант алел. Постигната е степен на откриване на мутация от 97,3%. Установено е, че Q188R е най-честата мутация в това проучване с честота 55,35%. Q188R е открит при алели при 29 пациенти и при един алел при четирима пациенти. A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) и M142K (6.25%) бяха намерени като втората най-често срещана мутация. E340 * е открит при шест хомозиготни пациенти, заедно с варианти N314D и L218L (алел на Duarte-1). Открит е алел на Duarte-1 с честота 10,71%. Алел Duarte-2 не е открит в това проучване.

Установено е, че алелите Duarte-1 и Duarte-2 присъстват с честота 2,3% и 1,4% при скрининга на 105 здрави индивида от турското население. Всички идентифицирани мутации и техните честоти на алели са обобщени в Таблица 1.

Маса в пълен размер

дискусия

Това проучване е проведено върху генетичен скрининг и характеризиране на спектъра на патогенни мутации на гена GALT в 56 случая на галактоземия (50 класически и 6 тип Duarte-1). Освен това бяха определени честотите на алелите Duarte-1 и Duarte-2 в турското население. Проучванията сред различни популации показват, че честотата на класическата галактоземия е между 1: 30 000 и 60 000. 2, 3, 11 Въпреки това, класическата галактоземия е по-често срещана в Турция с честота 1:23 775. 12

Повече от 250 мутации в различни етнически популации са описани в гена GALT по целия свят. Открихме 11 различни генетични мутации, две от които бяха нови, включително R258G и G310fsX49. Подробни анализи на ефектите на мутациите върху ензимната активност и структурата на протеините са достъпни в предишни публикации. 13, 14 Тук обсъдихме само възможните ефекти от новите мутации върху нивото на протеин, описани в това генетично скринингово проучване. Една от тях е нова мутация R258G, която е открита в съединението хетерозиготно състояние с Q188R. Възможно е остатъкът R258 на повърхността на протеина да участва в образуването на солен мост, като по този начин променя повърхностните свойства на молекулата. Страничната верига на глициновия остатък в мутацията R258G също е много малка. Мутацията може да повлияе на сглобяването на димера и стабилността или стабилността на мономера. G310fsX49 мутация на рамкова смяна води до стоп кодон в аминокиселинна позиция 49 зад изтрития нуклеотид.

Най-често срещаната мутация Q188R в гена GALT е открита при 55,35% от турското население в това проучване. Резултатите от нашата честота на Q188R от това проучване са съвместими с преди публикувани проучвания при турски пациенти с галактоземия, които съобщават за честота от 57% и 47%. 15, 16

Мутацията Q188R е най-често срещаният алел във всички европейски страни и честотата му варира значително в зависимост от популацията. Честотата на мутациите (между 45 и 93,6%) се отчита в следните страни в следните случаи: Ирландия, 93,6%; 17 Обединено кралство, 77%; 3 Португалия, 57,8%; 18 Холандия, 58,5%; 19 Испания, 50%; 18 Германия, 69%; 20 Австрия, 60%; 21 Полша, 51,3%; 22 Чехия и Словакия, 46%; 7 и Унгария, 45%. Както в тези европейски страни, беше установено, че това е най-честата причиняваща болести мутация в турското население и представените данни подсилват наблюдаваната закономерност, че честотата на мутацията Q188R намалява от запад на изток и север. на юг на европейския континент. 24

В това проучване на турското население K285N е регистриран само при 3,57% от населението. Мутацията K285N е втората най-често срещана мутация в повечето европейски страни. Честотата на този мутант алел варира от 19 до 33,8% в различни европейски популации. 7, 20, 21, 22, 23 За разлика от тези високи честоти, наблюдавани и споменати по-горе, някои популации имат ниска честота на алели за тази мутация, с разпределение между 2, 4 и 9, 8% в европейските страни. 18, 19, 25

Тези три мутантни алела A320T (7, 14%), E340 * (10, 71%) и M142K (6.25%) са вторите по честота при турски пациенти и се наблюдават по-често, отколкото в други популации. A320T и M142K са описани като редки варианти в други проучвания. 26

Спектърът на мутациите, открити досега в GALT, е както следва: M142K, G179D, Q188R, L218L, R231H, R258G, K285N, F294Y, N314D, G310fsX49, A320T, R328H и E340 *; всички те представляват по-голямата част от болестотворните алели в турското население за галактоземия поради дефекти на GALT гена. Повечето болестотворни вариации в GALT са дефинирани и резултатите от това проучване са съвместими с предишни резултати. 15, 16

Всички мутации в гена GALT се събират в екзони 5, 6, 8, 9 и 10 на гена. По отношение на всички открити мутации, екзони 6 и 10 представляват 79% от всички мутантни алели в нашата популация. Важно наблюдение е по-високата честота на мутации, локализирани в тези екзони при пациенти с турска галактоземия. Тези открития биха били полезни при молекулярно-диагностични проучвания за класифициране на алелите по отношение на приоритет за мутационен скрининг сред патогенни мутации, причиняващи галактоземия, броят на които в момента е повече от 250.

Интересното е, че както вече посочихме в литературата, ние забелязахме, че осем пациенти, носещи мутацията E340 *, са от турски произход и носят тази мутация в cis с N314D и L218L. Gathof и сътр. 27 за първи път съобщиха за турско момче с E340 *, N314D и L218L. Schuster et al. 28 съобщават за двама турски братя и сестри и за друго проучване на Seyrantepe et al. 15 от Турция споменаха друг турски пациент със същия генотип; в нашето проучване идентифицирахме шест пациенти, които са имали мутация E340 * в цис с N314D и L218L.

Хаплотипът E340 *, N314D и L218L са най-вероятно от предците на турците. В заключение трябва да идентифицираме произхода на мутацията; обаче не е възможно да се демонстрира основан на факти подход за установяващия ефект на хаплотипа в турската популация с данни, налични в момента от ограничен брой пациенти.

В това проучване ние също оценихме наличието на варианти на Duarte в турското население. Общо 105 здрави (n: 210 алела) индивиди бяха скринирани за наличие на варианти на Duarte на гена GALT и общо 8 алела (3,8%) бяха открити за N314D: пет (2,3%) бяха идентифицирани като Duarte-1 Вариант и три (1,4%) като вариант на Duarte-2. Честотата на алела Duarte в Европа показва значителна разлика в зависимост от региона. Разпределението на честотата е както следва: Северна Европа, 7,9%; Източна Европа, 5, 3%; Западна Европа, 6, 1%; и Южна Европа, 2, 0%. Афроамериканските и азиатските популации имат по-ниска честота на алела Дуарте, съответно 1,3% и 1,5%. Честотата на алела Duarte в нашето население е по-ниска от очакваната честота (% 3, 8) в сравнение с Източна Европа. Ако мутацията E340 * произхожда от общ предшественик, би било възможно този предшественик също да носи алела Duarte-1 и следователно повечето алели на Duarte са заедно с E340 *. Въпреки това, честотата на този алел при здрави индивиди е по-ниска, тъй като той не носи болестотворния хаплотип за Е340 *. Друго възможно обяснение за разнообразието и разликите в разпространението между алеите на Duarte, особено между често срещаните мутации в гена GALT, може да бъде географското местоположение на Турция, която пресича двата континента, Азия и Европа.

Висока степен на откриване на мутация от 97,3% е постигната чрез прилагане на последователност от микрочипове за секвениране в това проучване за скрининг на мутация. Този метод осигурява бърз и рентабилен подход за скрининг за мутации при наследствени заболявания. В сравнение с наличните класически генетични скринингови методи, ограничаването на микрочипове може да се счита за подходящ метод по отношение на скоростта, възпроизводимостта и приложимостта за анализ на хиляди нуклеотиди в една полева платформа. Това проучване е първият доклад за използването му при генетичен скрининг при пациенти с класическа галактоземия.