елементи

абстрактно

Коензим Q10 (CoQ 10) играе важна роля в енергийния метаболизъм на митохондриите чрез функцията си на електронен носител в дихателната верига. Генетичните дефекти, нарушаващи ендогенния биосинтетичен път на CoQ 10, могат да доведат до тежки метаболитни нарушения с поява в ранна детска възраст. Използвайки секвениране на екзома при деца с фатална неонатална лактатна ацидоза и енцефалопатия, ние идентифицирахме хомозиготен вариант на загуба на функция в COQ9. Функционални проучвания при пациенти с фибробласти показват, че отсъствието на COQ9 протеин е придружено от силно намаляване на COQ7, което води до значително натрупване на субстрата COQ7, 6-деметокси-убихинон 10. В същото време общото количество CoQ 10 е значително намалено, което се отразява в значително намаляване на активността на митохондриалната дихателна верига сукцинат-цитохром с оксидоредуктаза (комплекс II/III). Лентивирусната експресия на COQ9 възстановява всички тези параметри и потвърждава причинно-следствената роля на варианта. Нашият доклад за втория пациент с COQ9 разширява клиничния спектър, свързан с вариантите на COQ9, като подчертава значението на COQ9 по време на пренаталното развитие. В допълнение, спасяването на клетъчни нива на CoQ 10 и сложната активност на дихателната верига чрез допълване на CoQ 10 посочва значението на ранната диагностика и незабавното лечение.

Коензим Q10 (CoQ 10) е мастноразтворимо вещество, естествено вещество, което действа като съществен кофактор в митохондриалната дихателна верига. 1 Той действа като електронен носител от комплекс I и комплекс II до комплекс III и по този начин претърпява редокс цикъл между окислената (убихинон) и редуцираната форма (убихинол). В допълнение, CoQ 10 свързва митохондриалното бета-окисление на мастни киселини с дихателната верига, участва в биосинтеза на пиримидин и модулира апоптозата. 2 В своята редуцирана форма молекулата CoQ 10 служи като мощен антиоксидант.

CoQ 10 се получава чрез биосинтез или хранителен прием. Биосинтезата обаче е основен източник на CoQ10, който включва координирана функция на поне 13 гена (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ3, COQ4, COQ5, COQ6, COQ7, ADCK3, ADCK4, COQ9, COQ10A и COQ10B). Към днешна дата дефектите в осем от тези гени са идентифицирани като причина за първични нарушения на дефицита на CoQ 10 (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ4, COQ6, ADCK3, ADCK4 и COQ9), клинично хетерогенна група заболявания, които често се проявяват в детска възраст ., 4 Според Quinzii et al. Могат да се разграничат 5 основни клинични фенотипа: (1) енцефаломиопатия, (2) тежко детско мултисистемно заболяване, (3) нефропатия, (4) церебеларна атаксия и (5) изолирана миопатия. Идентифицирането на дефицита на CoQ 10 е важно, тъй като добавянето на CoQ 10 може да бъде от полза при определени условия.

Към днешна дата се съобщава само за един пациент с дефицит на CoQ 10 поради хомозиготен вариант на арест при COQ9 c.730C> T, р. Arg244 *, което води до новородена лактатна ацидоза, неконтролируеми гърчове и глобално забавяне на развитието. Използвайки секвениране на екзоми, ние идентифицирахме нов вариант, засягащ функцията на COQ9, свързан с неонатална енцефалопатия и ранна смърт. Нашият доклад разширява клиничния спектър, свързан с вариантите на COQ9, и сочи към тежък фенотип преди/неонатално начало. Фибробластите на пациенти с дефицит на COQ9 са подробно характеризирани и са показани функционалните последици от генетичния дефект.

Доклад за случая

Момчето, за което се съобщава тук, е второто дете на здрави първокласни турски родители. 13-годишният му брат е здрав. Бременността е била нормална до 27-та гестационна седмица, когато се отбелязва олигохидрамнион. По това време родителите отхвърлиха препоръчаното цезарово сечение. И накрая, бебето се роди през 36-та седмица от бременността чрез цезарово сечение поради анхидрамнион. Резултатът за APGAR беше 5/4/6. Новороденото е било малко за гестационна възраст с тегло при раждане 1440 g, дължина 39,5 cm и обиколка на главата 28,8 cm (всички стойности под 3-тия процентил). Не са наблюдавани дисморфични стигми. По време на непосредствения постнатален период пациентът е имал слабо дихателно усилие, мускулна хипотония, брадикардия и генерализирана цианоза. Бебето беше интубирано и прехвърлено в отделение за интензивно лечение за новородени. Лабораторните тестове разкриват лактатна ацидоза (до 22 mmol/l; стандарт: 160), което показва дефект в метаболизма на CoQ 10. Хистологичните изследвания на мускулна и чернодробна тъкан са без конкретни находки.

лактатна

а ) Ултразвук на мозъка при новородено с патогенен вариант на COQ9. Ляв и среден панел: дясна и лява парасагитални гледки, съответно, показващи хиперехоечен сигнал в базалните ганглии (стрелка) и двустранни циорози на хороидеалния сплит (звездичка). Десен панел: коронален изглед, демонстриращ симетрични аномалии на хиперехогенните базални ганглии, предполагащи синдром, подобен на Leigh. ( б ) Схематична диаграма, показваща транскрипта, генериран в присъствието на делеция c.521 + 1. Хроматограмата показва, че делецията води до пропускане на екзони 4 и 5 при фибробластите на пациента. ( ° С ) Уестърн блотинг върху фракции пациенти и контролни фибробласти, обогатени с митохондрии (представително изображение). В клетките на пациентите не се открива нетрансдуциран (Q) COQ9. Сигналът се възстановява след лентивирусна трансдукция с cDNA от див тип (+) CQ9. В допълнение беше използвано антитялото COQ7, което демонстрира сериозно намаляване на COQ7 протеина в клетките на пациентите. Porin (VDAC) е използван като маркер за зареждане.

Изображение в пълен размер

Материали и методи

Подробно описание на материалите и методите, използвани в този документ, може да се намери в допълнителния материал.

Резултати и дискусия

За да разкрием генетичната причина за заболяването, извършихме секвениране на екзома, както е описано по-горе. 7 Приемайки автозомно-рецесивен начин на наследяване, нашите анализи се фокусираха върху хомозиготни и прогнозирани хетерозиготни несинонимни варианти с MAF 9

По-нататък изследвахме ефекта на варианта върху експресията на COQ9 чрез имунодеколация на обогатени с митохондрии протеини, използвайки антитяло, специфично за COQ9. Използвайки различни количества митохондриални протеини, не успяхме да открием COQ9 в клетките на пациентите, докато ние винаги откривахме COQ9 в контролите, което показва деградация на пресечения протеин (Фигура 1в).

Освен това, ние измерихме няколко митохондриални ензими спектрофотометрично, използвайки митохондриално обогатени фибробластни фракции. За да определим активността на дихателната верига II/III, измерихме редукцията на цитохром c. За комплекс IV активност, ние проследихме окислението на редуциран цитохром с и активността на цитрат синтазата, ензимен маркер на митохондриалната матрица, беше измерена след редукция на 5,5'-дитиобис- (2-нитробензоена киселина). В съответствие с дефекта на биосинтеза на CoQ 10 и дефекта, открит във фибробластите, клетките на пациента показват значително намаляване на активността на комплекс II/III (Фигура 2а).

Експресията на COQ9 в контролни клетки с нормални или намалени нива на CoQ 10 поради варианти на COQ2 няма ефект върху комплекс II/III активност (Фигура 2а). След експресия на кДНК от див тип във фибробласти на пациенти, носещи варианти на COQ9, наблюдаваме значително 4-кратно увеличение на активността на комплекс II/III.

Тъй като COQ9 участва в биосинтеза на CoQ 10, общото количество CoQ10 е измерено чрез течна хроматография с ултрависока производителност, съчетана с тандемна мас спектрометрия (UPLC-MS/MS). И двете клетъчни линии на пациента на CoQ 10 показват значително намалено количество CoQ 10, с 10 pmol/mg протеин във фибробласти с вариант COQ2 и 7,3 pmol/mg протеин във фибробласти с вариант COQ9 (нормален диапазон 46, 5-90, 5 pmol/mg протеин). След трансдукция, мутантните фибробласти COQ9 показват значително (приблизително 3-кратно) увеличение на нивата на CoQ 10, докато нивата на CoQ 10 остават непроменени в мутантните клетки на COQ2 (Фигура 2b). Тези открития са доказателство за причинно-следствена връзка между идентифицирания вариант на COQ9, дефицит на CoQ 10 и намалена активност на комплекс II/III.

Изследвания върху модел на мишка и скорошни проучвания при хора показват, че COQ9 е липид-свързващ протеин, който има структурна хомология с семейството TFR (бактериални транскрипционни регулатори). 9, 11 Lohman et al. 9 демонстрира, че COQ9 е малко вероятно да действа като транскрипционен фактор и предполага, че структурният компонент на TFR се възпроизвежда по време на еволюцията. Вместо да катализира специфична реакция на биосинтез само на CoQ10, се предполага, че COQ9 се свързва или с CoQ 10, или с предшественика CoQ 10 и образува комплекс с COQ7. COQ7 катализира хидроксилирането на 6-деметокси-CoQ10, което е предварителен етап в биосинтезата на CoQ. Значително намалено количество COQ7 в клетъчната линия на пациента, което се спасява чрез увеличаване на COQ9, показва COQ7 стабилизираща функция на COQ7 (Фигура 1в).

Трябва да се отбележи, че потенциален междинен продукт на биосинтеза на CoQ10 е описан при COQ9-мутантни мишки, както и при човешки фибробласти. 6, 11 При мишки този метаболит е идентифициран като 6-деметокси-убихинон 9. Все още липсват подробни проучвания върху хора. За да характеризираме метаболита в човешките клетки, извършихме различни аналитични техники на UPLC-ESI-MS/MS, като сканиране, сканиране на прекурсорни йони или режим на наблюдение на множество реакции. В съответствие с проучвания върху мишки, ние специално открихме 6-деметокси-убихинон 10 във COQ9 фибробласти (Фигура 2в и d). Тъй като 6-деметокси-убихинон 10 е COQ7 хидроксилиран, за да образува 6-хидрокси-убихинон 10, натрупването на това междинно съединение може да се обясни с намаленото количество COQ7. 9 Както се очаква, експресията на COQ9 нормализира нивата на COQ7 и 6-деметокси-убихинон 10 (Фигура 2г). Метаболитът не е открит в други клетъчни линии.

Добавянето на CoQ 10 е полезно при някои пациенти с дефицит на CoQ 10. За да тестваме ефекта от лечението в нашите клетъчни линии, ние ги допълнихме с 5 μM CoQ 10 за 1 седмица според Lopez et al. 12 CoQ 10 лечение спаси комплекс II/III активност във фибробласти на мутантни COQ9-мутанти значително до -80% от най-ниската контролна стойност (Фигура 2д). Почти същият ефект е наблюдаван при COQ2-мутантни фибробласти, докато не са измерени разлики в контролните фибробласти. Съдържанието на CoQ 10 във фибробластите на пациентите се е увеличило значително до приблизително 11 пъти след лечението и е достигнало контролни стойности (Фигура 2b). Интересното е, че не е открит 6-деметокси-убихинон 10 при пациенти с фибробласти с генетичен дефект в COQ9 след лечение с CoQ 10, което може да се дължи на намалена ендогенна биосинтеза чрез достатъчно екзогенно добавяне на CoQ 10 (Фигура 2г).

И накрая, нашето проучване дава допълнителна представа за клиничните и клетъчните последици от дефицита на COQ9. Тежкият клиничен ход, наблюдаван при нашия пациент, предполага критична функция на COQ9 още по време на пренаталното развитие. Случаят, заедно с описанието на Duncan et al., Поставя дефицита на COQ9 сред най-сериозните форми на нарушения на метаболизма на CoQ 10, сравним с тези, описани при пациенти с нарушения на COQ2 или COQ4. Необходими са обаче допълнителни клинични описания, за да се оцени специфичният клиничен спектър на пациенти с мутации на COQ9. Както е предложено от Duncan et al. 6 Лечението с CoQ 10 може да бъде полезно при деца с дефицит на COQ9. Следователно, при неясни случаи на митохондриална болест при новородени/в ранна детска възраст се препоръчва емпирично лечение с CoQ 10. .