мазнини

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Характеризиране на микробиома Macaca fuscata
  • Диетата основно структурира чревния микробиом
  • Диетата на майката структурира потомството на микробите
  • HFD намалява потомството Campylobacter
  • дискусия
  • методи
  • Експериментален дизайн
  • Последователност на микробиомите
  • Анализ на данни 16S
  • Количествена PCR
  • Повече информация
  • стъпки
  • Биопроект
  • Допълнителна информация
  • PDF файлове
  • Допълнителна информация
  • Коментари

елементи

  • дисбиоза
  • Метаболитни нарушения
  • микрофлора
  • Хранене

абстрактно

Чревният микробиом е уникална екосистема и основен медиатор на метаболизма и затлъстяването при бозайниците. Въпреки това, проучвания, изследващи ефекта на храненето върху образуването на чревни микробиоми в ранна възраст, най-вече липсват, особено при модели на примати. Тук съобщаваме, че високомаслената майчина или постнатална диета, но не и самото затлъстяване, структурира чревния микробиом на потомството в Macaca fuscata (японски макак). Получената микробна дисбиоза се коригира само частично след отбиване чрез диета с ниско съдържание на мазнини. Неочакваното ранно излагане на диета с високо съдържание на мазнини намалява количеството непатогенни кампилобактери в младежките черва, което предполага потенциална роля на хранителните мазнини при формирането на коменсални микробни съобщества при приматите. Нашите данни поставят под въпрос концепцията за чревния микробиом, причиняващ затлъстяване и по-скоро предоставят доказателства за приноса на майчиното хранене за установяването на микробиота, което от своя страна влияе върху поддържането на метаболизма в червата.

Чревният микробиом е здрава екосистема, обитавана от почти 100 трилиона бактерии. Тези коменсални бактерии кодират ензимни пътища, които позволяват метаболизма и синтеза на мастни киселини и витамини 1, 2. При раждането се смята, че вагиналните и фекалните микробиотици от майката инокулират устната кухина на новороденото, което е в основата на чревната микробиота при потомството 3, 4. Тъй като детето расте и се въвеждат нови храни, микробиомите се разширяват в богатство и разнообразие и достигат стабилно състояние малко след отбиването, отразявайки възрастните микробиоти 5, 6. Ефектът от майчиното хранене на майката, начинът на приложение и лактацията върху филогенетичната структура на детския и младежки чревен микробиом все още е недостатъчно изследван при добре контролирани модели 3, 4, 5, 7 .

В това проучване установихме, че Mucaca fuscata (японски макак) е представителен модел за изследване на човешкия микробиом. Освен това ние сме в състояние да изследваме ролята на майчиното хранене по време на бременност и кърмене за установяването на младежки микробиом. Установихме, че докато микробиомът е структуриран предимно на основата на диета, ние откриваме постоянни промени в младежкия микробиом въз основа на храненето на майката; тези постоянни промени са настъпили въпреки съжителството на нашите непълнолетни кохорти. Тези проучвания допринасят за разширяване на работата и предоставят доказателства, че диетата до голяма степен оформя микробиома ни. Тези проучвания допълнително дават представа за това как развитието на микробиома потенциално е повлияло върху развитието на човешката диета, за да насърчи появата на метаболитни болестни състояния.

резултатът

Характеризиране на микробиома Macaca fuscata

За да изследваме относителния принос на манипулациите с майчиното и телесното хранене за образуването на микробиоген при примати, извършихме метагеномни проучвания в нашия добре характеризиран модел на безпородния японски макак (Macaca fuscata) 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32. Първо определихме сравнителната значимост на M. fuscata при хора на множество места в тялото чрез събиране на орални, вагинални и чревни проби от здрави небременни възрастни примати и извършване на 454 пиросеквениране на 16S рРНК във връзка с филогенетичен анализ на главните координати (PCoA ). Подобно на хора 2, 20, 33, но уникално за мишките, ние наблюдавахме дискретна агрегация на орални, вагинални и чревни микробиоти, което означава, че тези телесни места до голяма степен задържат уникални ниши на популацията, въпреки че таксони, споделени с някои индивиди, демонстриращи изпражнения. вагината (фиг. 1а).

ДНК се изолира от тампони от M. fuscata или H. sapiens, получени от червата (ректума, колоректалната и изпражненията), вагиналната или устната кухина. Проведено е 16S rDNA секвениране с помощта на 454 FLXtitanium система и последователностите са анализирани с помощта на софтуера QIIME. а ) PCoA графики, показващи бета разнообразие от проби, взети от чревни (сини), вагинални (червени) или орални (оранжеви) тампони. Броят на животните (n), използвани за всяко място на тялото, е посочен в скоби в легендата на фигурата. б ) Броят на бактериите, изолирани от чревната, вагиналната или устната кухина на M. fuscata (тази работа) или H. sapiens (използвайки HMP, достъпен на //www.hmpdacc.org/). Всеки щам е представен във филогенетичното дърво с различен цвят. Общият брой на майките и малките, от които е получена характеристиката на микробиона, е 50, като пробите идват от няколко части на тялото.

Изображение в пълен размер

Освен това сравнихме таксоните на всеки сайт от тялото с публично достъпни данни от Проекта за човешки микробиоми (HMP; hmpdacc.org). На ниво финал чревните таксони са сходни и са доминирани от Bacteroidetes и Firmicutes (фиг. 1б). Въпреки това, на ниво род, имаше очевидни разлики в Bacteroidetes. По-специално, появата на бактерии при хората и Prevotella в макаците най-вероятно е отражение на хранителните различия. Бактероидите кодират ензими за смилане на наситени мазнини и животински протеини, които са по-често срещани в западната диета 5, докато метаболитните реконструкции в Prevotelle са доминирани от пътища за храносмилане на растителен ксилан и целулоза, които са по-често при всеядната диета на M. fuscata и аграрни популации население на Буркина Фасо 5. Оралната микробиота е била приблизително приблизително на ниво щам, с изключение на по-голямото относително изобилие от Fusobacteria при хора (Фиг. 1b). Като цяло чревните и устните микробни съобщества на M fuscata са подобни на тези при хората.

Вагиналният микроб M. fuscata съдържа по-малко Lactobacillus, отколкото при хората, беше забележимо по-разнообразен от хората и съдържа таксони, най-често свързани с чревния микробиом. Докато повишеното бактериално разнообразие в човешкия вагинален микробиом се свързва с бактериална вагиноза 34, 35, други примати (напр. Бабуини) носят вагинално микробно разнообразие, подобно на това, което наблюдаваме при здрави, бременни макаци 36. Обединяването на някои вагинални и чревни проби (фиг. 1а) предполага, че тези икономически профили на изобилие в макаците най-вероятно се дължат на анатомични и хигиенни разлики, които водят до фекално замърсяване.

Диетата основно структурира чревния микробиом

Независимо от затлъстяването и инсулиновата резистентност, HFDS (затлъстяване, инсулинова резистентност) и HFDR (лоши, чувствителни към инсулин) клъстери се групират и се различават от CTD отделенията по PCoA (P = 0,001 според дисперсионния мултивариатен анализ на пермутация (PERMANOVA)). 2a) . ). Тази констатация беше потвърдена от степента на алфа разнообразие и видово богатство, които не успяха да открият значителна разлика между язовирите HFDS и HFDR (Допълнителна фигура 1б, в). Интересното е, че няма очевидни разлики в плазмените нива на циркулиращи възпалителни цитокини 37, които биха обяснили различната агрегация въз основа на диетата. Съобщава се обаче за повишаване на общите мастни киселини (наситени, мононаситени, полиненаситени и есенциални) и n-6 мастни киселини при язовирите, консумиращи HFD 38, което е вероятно обяснение защо в чревните микробиоми не се откриват навици и инсулинова резистентност .

Взети са чревни проби от M. fuscata, поддържани на изокаретична диета, съдържаща или 13% мазнини (контролна диета), или 36% мазнини (диета с високо съдържание на мазнини). ДНК се изолира от чревното съдържание и се извършва пиросеквенция от 16S рДНК (454 FLXtitan). Последователностите бяха анализирани с помощта на QIIME софтуер. а ) Графика PCoA, демонстрираща различното групиране на индивиди с контролна диета (CTD, зелена), лоша диета (HFDR, тъмно синьо) или диета с високо съдържание на мазнини (HFDS, светло синьо). Индивидите се групират значително въз основа на диетата (P = 0,001 според PERMANOV). Броят на животните във всяка категория (n) е даден в скоби на легендата. б ) Графика, показваща разликите в изобилието от щам между субектите на контролна диета (CTD), диета с лоша диета (HFDR) и затлъстяване с високо съдържание на мазнини (HFDS). Обясненията вдясно от графиката показват цвета на всяка представена бактерия.

Изображение в пълен размер

Взети са чревни проби от M. fuscata, поддържани на изокаретична диета, съдържаща или 13% мазнини (контролна диета), или 36% мазнини (диета с високо съдържание на мазнини). ДНК се изолира от чревното съдържимо и се извършва пиросеквенция от 16S рДНК (454 FLXtitan). Последователностите бяха анализирани с помощта на QIIME софтуер. а ) Кладограма, получена от анализ на LEfSe 16S последователности. Зелените сенчести зони показват бактерии с по-висока честота при животни, хранени с контролна диета (CTD), докато сините сенчести области показват бактерии с по-висока честота при животни, хранени с високомаслена диета (HFD). б ) Относителен брой бактериални родове сред животни, хранени с контролна диета (CTD, зелени ленти) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD, сини ленти). Графичните полета показват разпределението на данните с линия в центъра на полето, представляваща средната стойност. Лявата страна на медианата показва третия квартил, а дясната страна - първия квартил. Редовете вдясно от полето показват 1,5 в интерквартилния диапазон на долния квартил, а линиите вляво показват 1,5 в интерквартилния диапазон на горния квартил. Точките представляват извънредни стойности.

Изображение в пълен размер

Диетата на майката структурира потомството на микробите

6-месечна или до 1-годишна възраст, което е приблизителният еквивалент на развитие при хората за появата на микробиота при възрастни 3, 46 .

Изображение в пълен размер

Предвид постоянството на ефекта от експозицията на HFD на майката върху получените чревни таксони на потомството, ние се опитахме да определим кои членове на рода и таксономичните метаболитни пътища или модели на предаване са довели до тези находки. Изборът на функцията на Borutus от получените 16S метагеномни данни разкрива HFD-индуцирано изчерпване на протеобактерии, по-специално Epsilonproteobacteria Campylobacter spp. и Helicobacter spp, заедно с обогатяването Firmicutes Ruminococcus и Dialister (фиг. 5а). Когато допълнително изследвахме метагеномни данни, получени от 16S на ниво род, установихме, че Campylobacter spp намалява при потомството след излагане на HFD по време на бременност/кърмене или след отбиване (Фигури 5b и 6). Както в нашата кохорта на CTD на майката (Фигури 2b и 3b), юношите, поддържани на отбит CTD, носят подобно повишена Treponema (Фигури 5 и 6). Анализът на чревните таксони на дебелото черво на потомството показва намалени нива на видово богатство (Допълнителна фигура 2б) и разнообразие (Допълнителна фигура 2в) при всякакви нива на излагане на високи хранителни мазнини; това наблюдение е потвърдено от LEfSe (допълнителна фигура 2г).

Топлинна карта, показваща промените на ниво пол между M. fuscata, които са консумирали или контролна, или диета с високо съдържание на мазнини по време на бременност/кърмене и/или отбиване. Относителното количество на всеки род се обозначава с цветен градиент от сиво (ниско изобилие) до червено (голямо изобилие). Картата на топлината, създадена с помощта на разстоянието в Манхатън и йерархичното групиране, се основава на средна взаимовръзка. Легендата над горещата карта показва диетата и храненето на майката след отбиването на всеки представен непълнолетен. Въз основа на дендрограмата се наблюдава клъстер от проби от малки, консумиращи контролна/контролна диета, поради по-големия брой Campylobacter. Броят на непълнолетните (n) във всяка кохорта е даден в скоби в легендата на фигурата.

Изображение в пълен размер

Нашите наблюдения колективно оспорват схващането, че по своята същност съществува „затлъстял“ микробиом и по-скоро подкрепят възникващи данни от мишки и хора, които предполагат прехвърляемо и модифицируемо взаимодействие между диетата и микробната общност, което засяга биологията на гостоприемника (затлъстяване) 9, 24 Нашите данни, които демонстрират ролята на храненето на майката, а не на затлъстяването на майката като такова, за формирането на чревния микробиом на потомството на 1-годишна възраст, са в съответствие с предишните ни констатации за ефекта му върху феталния епигеном 27, 28, 30. Въпреки че по-рано сме виждали, че след отбиването диетичното обръщане може да спаси експресията на гени, участващи в циркадния път 27, 28, обръщането след отбиването не регулира всички промени в маточния епигеном на плода 30. Тук описваме друга постоянна промяна в потомството поради храненето на майката, като родът Campylobacter намалява поради храненето на майката. В допълнение към последиците за ролята на микробиотата в промяната на епигенетиката или обратно, тези постоянни промени в микробиома могат да подкрепят промените в тревожното поведение, които вече са описани 32. Като цяло тези данни разкриват потенциални пътища, участващи в кръстосани препратки между биологичните системи.

методи

Експериментален дизайн

Последователност на микробиомите

Взети са проби от стомашно-чревния тракт (изпражнения, издигане на дебелото черво, ректума), вагиналната или устната кухина и ДНК е изолирана с помощта на комплект за изолиране на ДНК Powersoil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Взети са чревни проби от последното изпражнение, съдържанието на луминалната страна на възходящото дебело черво и чрез поставяне на памучен тампон в ректума след аутопсия. Взети са орални и вагинални проби чрез разкъсване на тялото. След екстракция на ДНК, 16S рДНК на бактериите се усилва и се използват баркодове с праймери V3V5 за идентифициране на пробите преди секвениране 454; получените последователности бяха анализирани чрез количествен поглед върху софтуера за микробна екология (QIIME) 56. Последователността на праймера V3V5 с малки букви е както следва: 5'-cctatcccctgtgtgccttggcagtctcaGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 '(напред B-354F праймер) и 5'-ccatctcatccctgcgtgtctccgactCTTNN-92N.

Анализ на данни 16S

Предварителната обработка включваше премахване на отчитането без последователност на баркод или грунд и след това премахване на отчитането с дължина под 200 нуклеотида и отчитане с минимално средно качество по-малко от 20. AmpliconNoise 57 беше използван за коригиране на грешки, въведени в PCR и пироконвенция, както и премахване на химерни последователности. Първо, разстоянието на потока беше изчислено и йерархично групирано с пълна връзка. След това беше използван алгоритъм за максимизиране на очакванията, за да се премахне пироквадентния шум и показанията бяха допълнително съкратени до 400 базови двойки. PCR грешката се изчислява между последователностите и се групира, за да осигури вход за SeqNoise. След това PCR грешките бяха отстранени чрез стъпката SeqNoise. Грундовете и баркодовете бяха изрязани от дехумизирани последователности. И накрая, дехумираните последователности бяха допълнително групирани чрез пълно групиране на връзките в оперативни таксономични единици (OTU) при ниво на сходство от 97% от AmpliconNoise. OTU се появи през 58г. Таксономичното присвояване на всяка последователност беше съкратено на най-специфичното таксономично ниво с оценка на достоверност най-малко 85%.

Количествена PCR

В допълнение, ДНК, изолирана от M. fusata, също е подложена на PCR амплификация за рода Campylobacter и универсална 16S рДНК, както е описано по-рано 47, 65. Праймерите, използвани за специфична за Campylobacter PCR, са C412F 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC -3 'и C1288R 5'-GGATGACACTTTTCGGAGC-3'. Тези праймери генерират 812 bp продукт, използвайки 28 цикъла PCR амплификация при 94 ° С за 1 минута, 55 ° С за 1 минута и 72 ° С за 1 минута. Универсалната 16S рДНК се амплифицира с помощта на праймерите, описани по-горе (16SuniversalFor и 16SuniversalRev) и генерира продукт от 462 bp след 30 цикъла на амплификация при 95 ° C за 1 минута, 60 ° C за 1 минута и 72 ° C за 1 минута. PCR продуктите се провеждат на 3% агарозен гел, съдържащ етидиев бромид. Гелът е визуализиран и количествено определен с помощта на VisionWorks LS софтуер за анализ (Upland, Калифорния) 66 .

Повече информация

Кодове за достъп: Метаагеномните данни се съхраняват в базата данни BioProject под код за присъединяване PRJNA231152.

Как да цитирам тази статия: Ma, J. et al. Диетата с високо съдържание на мазнини по време на бременност постоянно променя микробиомите на потомството в модела на приматите. Нат. Общ. 5: 3889 doi: 10, 1038/ncomms4889 (2014).