фазата

  • елементи
  • абстрактно
  • Въведение
  • резултатът
  • Намаляването на обема на храната предизвиква фазово изместване в периферните часове
  • Честотата на хранене с еднакви интервали на хранене не влияе на фазата на периферния часовник
  • Хранителните модели, които имитират човешките диети, променят фазите на периферния часовник
  • дискусия
  • методи
  • звяр
  • Протокол за наблюдение in vivo
  • Анализ на данните от мониторинга in vivo
  • Протокол за планирано хранене
  • Статистически анализ
  • Коментари

елементи

  • Генната експресия
  • Генна регулация
  • изображения
  • физиология

абстрактно

Периферният циркаден часовник при бозайниците е силно завладян от светло-тъмно и хранене цикли. Техните физиологични функции се поддържат чрез фазова синхронизация на органи, използвайки модели на генна експресия за часовници. Малко обаче се знае за адаптирането на периферните часовници към времето на многодневното хранене. Тук изследвахме ефекта от нередовните хранителни навици по отношение на времето и обема върху техните периферни часове in vivo. Установихме, че фазата на периферния часовник се променя от количеството храна и интервала между времето за хранене, но не се влияе от честотата на хранене, докато интервалът остава фиксиран. В допълнение, нашите резултати предполагат, че късната вечеря трябва да бъде разделена на два полупансиона, за да се смекчи ефектът от нередовните фази на периферния часовник.

Циркадният часовник играе ключова роля в ендогенното поддържане на физиологичните функции, включително цикъла на сън и събуждане, телесната температура, метаболизма и функцията на органите 1. Часовниковите системи на бозайниците включват гени на часовника; по-специално, период 2 (Per2) представлява транскрипционна и транслационна обратна връзка, която заедно с часовника, BmaI и Cry1, генерира 24-часови ритми на нива на РНК и протеини на ниво единична клетка. Тази система е активна не само в супрахиазматичното ядро ​​(SCN), централният осцилатор на циркадния часовник на бозайниците, но и в тялото 1, 2, 3. Анализът на временните микрочипове в чернодробните тъкани показа, че приблизително 10% от всички гени показват разлики в експресията през деня и нощта, което предполага, че ритъмът на физиологичните събития се регулира от циркадната система на часовника. .

Използването на планирани експерименти с хранене с мишки за изследване на фазовото отделяне на поведенчески и физиологични ритми, както и ритми на експресия на гени на часовника, предполага, че храната е мощен фактор за завладяване на периферните часовници 1, 3. Това увлечение е независимо от SCN, както се съобщава в проучването за лезии SCN 17. Чернодробният часовник се поема лесно от храната чрез хранителни или метаболитни фактори като въглехидрати, аминокиселини 18 и инсулин 19. По-рано съобщавахме, че приемът на храна или инжектирането на инсулин рязко повишава регулацията на Per2 и намалява експресията на гена Rev-erbα в черния дроб 19. Етикетът за хранене се различава от светлинната пътека по това, че тялото получава захранващи сигнали като непараметрични импулсни сигнали, като закуска, обяд и вечеря, докато SCN-зависимите ритми се улавят от параметрични и непараметрични светлинни сигнали. .

Въз основа на тези факти, нашата цел в това проучване беше да разберем как отделните импулси на храна стимулират периферния часовник през деня и как фазата на периферния часовник се регулира от няколко хранения. Тук използвахме наскоро въведен in vivo метод за наблюдение на периферните часовници, за да определим как хранителните навици, подобни на тези при хората, определят фазите на периферния часовник при мишки.

резултатът

Намаляването на обема на храната предизвиква фазово изместване в периферните часове

При проучвания при хора циркадната парадигма без хранене обикновено се използва за намаляване на увлечението, предизвикано от храната 21; поради това използвахме тази парадигма в нашия експеримент, като първо осигурихме на мишките 6 хранения на ден на редовни интервали. По този начин ние изследвахме ефекта от обема на храната върху фазата на периферния часовник, използвайки този график, при който всеки път се сервираше същият обем храна, като се използва домашна автоматизирана система за хранене 22. За да се избегнат остатъци по време на периода на хранене, мишките са леко ограничени в калориите в този експеримент. Използвайки техниката, описана по-рано 23, използвахме PER2: LUCIFERASE мишки (PER2: LUC), за да измерим активността на Per2 в периферните тъкани чрез in vivo изображения на кожата (Фигури 1А и В). При условия на хранене, ако е необходимо, активността на PER2: LUC в периферните тъкани (бъбреци, черен дроб и подчелюстна жлеза) е била най-висока около времето на Zeitgger 19 (ZT 19; ZT 0 показва времето, в което са били включени светлините; Фигура 1B) установи, че 20%, но не и 10%, ограничаване на храненето при необходимост е било достатъчно, за да накара мишките да консумират всичките си диети в рамките на 4-часов интервал на хранене. Седем дни след началото на този протокол за хранене, мишките са могли да изядат цялата доставена храна в рамките на 3 минути след пристигането на храната.

Схематични планове за хранене (вляво) и средни PER2: LUC пикови фази на всеки орган за всяко състояние на хранене (вдясно). Бели и черни ленти по хоризонталната ос показват 12-часови условия на околната среда в светлина и тъмнина. Белите кръгове показват времето за хранене, а размерът на кръга е свързан с обема на храната. Всички хранения бяха разпределени равномерно през целия ден и обемът на всяко хранене през целия ден в групата беше еквивалентен; броят на храненията е 6, 4, 3 или 2 хранения на ден. Периферните часове се наблюдават след 2 седмици привикване към всяко състояние на хранене. Данните са представени като средна стойност ± SEM, с n = 6 мишки за състояние. Еднопосочната ANOVA не показва значителни разлики в нито една от изследваните тъкани. Sub Gla, субмандибуларна жлеза; ZT, времето на Цайтгебер.

Изображение в пълен размер

Хранителните модели, които имитират човешките диети, променят фазите на периферния часовник

За да имитираме хранителните навици на човека, ние се фокусирахме върху състоянието, при което мишките получават 3 хранения на ден. Първо изследвахме различните моменти от време, в които се сервира храна, т.е. ZT 12, 18 и 0 или ZT 0, 6 и 12, за да разберем разликата между дневния (ZT 6) и нощния (ZT 18) график на хранене (Фигура 3А) . Фазите на периферния часовник, индуцирани чрез хранене при ZT 0, 6 и 12, се различават значително от фазите, предизвикани от хранене при ZT 12, 18 и 0. Освен това, фазата на периферния часовник на мишки, хранени 3 пъти при ZT 12, 18, и 0 е подобна на фазата на мишки, хранени ad libitum (Фигури 1 и 3А).

Схематични планове за хранене (вляво) и средни PER2: LUC пикови фази за всеки орган при условия на хранене (вдясно, средна стойност ± SEM). Бели и черни ленти по хоризонталната ос показват 12-часови условия на околната среда в светлина и тъмнина. Белите кръгове показват времето за хранене, а размерът на кръга е свързан с обема на храната. Стрелките показват времето за подаване, което е следвало най-дългия интервал без подаване за всяко състояние. Периферните часове се наблюдават след 2 седмици привикване към всяко състояние на хранене. (А) фаза на периферния часовник при мишки, хранени с 3 хранения, разпределени равномерно през деня и нощта; храна се прилага при ZT 0, 6 и 12 (a) или при ZT 12, 18 и 24 (b); n = 6 мишки на условие. * p 24; следователно времето за вечеря беше забавено в това проучване. Размерите на хранене бяха както следва: закуска, 0,9 g (27% от общия обем храна); обяд, 1,2 g (36%); и вечеря, 1,2 g (36%). На фигура 3В фазата на периферния часовник, когато се контролира от програмата за хранене ZT 12, 17 и 1, е подобна на фазата, когато е последвана от програмата за хранене ZT 12, 18 и 0. Въпреки това, ZT 12, 17, 3 или 4 схема на хранене предизвика драматично изместване на фазата.периферни часове до фаза, подобна на тази, наблюдавана в схемата на хранене ZT 0, 6 и 12.

Трето, разделихме обема на храната, сервирана на ZT 4, на половината от сервираната на ZT 0 и ZT 4, за да премахнем фазовите ефекти от късната вечеря. След анализ на периферните часове съгласно графика за хранене ZT 12, 17 и 4, променихме режима на хранене на същите мишки до режим на хранене ZT 12, 17, 0 и 4. Две седмици след промяната на новия график, периферните часовници са леко изместени назад за бъбреците и черния дроб и значително са се изместили назад за подчелюстната жлеза в сравнение с предишния график на хранене, т.е. ZT 12, 17 и 4. Това означава, че десетият преди късната вечер може да предпази от фазовото изместване на периферния часовник.

дискусия

В настоящото проучване ние изследвахме in vivo функцията на периферните часовници при мишки, изложени на многократни режими на хранене, които са предназначени да имитират човешки хранителни навици. Първо, открихме, че периферният часовник е напреднала фаза след намаляване на приема на храна (Фигура 1), и второ, че сигналът за храна, получен след дълъг пост, е силен фактор за определяне на фазата на периферния часовник (Фигури 2 и 3).

Мендоса и сътр. 25 по-рано са показали, че намаленият общ прием на храна, включително 6 хранения на ден, е предизвикал фазово изместване не само в ритмите на двигателната активност, но и в моделите на експресия на генни часовници в SCN. Този фазов последователен ефект в SCN може да е отговорен за промените във фазовите периферни часовници, наблюдавани в това проучване (Фигура 1). Също така установихме, че ограничаването на калориите влияе по различен начин на напредъка в различните органи. Бъбреците показаха по-силен отговор от останалите наблюдавани тъкани (Фигури 1D, 2 и 3). Механизмът, лежащ в основата на тази фаза на ограничаване на калориите, все още е неизвестен. Една от възможностите е, че зависимите от кръвната захар промени в активността на AMPK могат да променят периода на периферния часовник 9 и че активността на AMPK може да бъде тъканно специфична. Тъй като обаче има много сигнални пътища, включени в увличането на периферния часовник 3, са необходими допълнителни изследвания на ефектите от стимулирането на храната в различни органи.

Периферните фази на часовника не са засегнати от различни честоти на хранене (2, 3, 4 и 6 хранения на ден), когато храненето се извършва на същите интервали, докато се наблюдават ясни промени във фазите, когато 3 хранения се сервират на неравномерни интервали на ден (Фигура) . 2 и 3). Този резултат може да се обясни, като се вземе предвид дължината на интервала между точките на времето за хранене във всяко състояние на хранене. Храната, осигурена след дълъг период на гладуване (обозначен със стрелките на фигура 3), е особено силна при нулиране на периферния часовник. Преди това сме демонстрирали подобни резултати в чернодробния PER2: LUC ритъм при хранене 2 пъти на ден, както е оценено ex vivo чрез тъканна култура 22; Ясно е, че ефектът от интервалите на хранене е силен дори при мишки, хранени три пъти дневно по време на нормален светло-тъмен цикъл.

В заключение, интегрирането на сигнали от множество режими на дозиране определя един дневен пик на ритмите за експресия на гена в периферния часовник in vivo. Тази адаптация на периферния часовник зависи от количеството храна и интервала между времето за хранене, дори по време на нормален цикъл светлина-тъмнина. Поради това резултатите ни показват, че хранителните навици на хората в съвременното общество са се променили, за да причинят нередовни фази на периферните часове. Нашите резултати обаче също така показват, че нередовните периферни часовници могат лесно да бъдат променени чрез регулиране на хранителните навици.

методи

Всички животни са били отглеждани и използвани с разрешението на Комитета за експерименти с животни към Факултета по наука и технологии на Университета Васеда (разрешение 2011-A49) и в съответствие със Закона (№ 105) и Известието (№ 6) от Японско правителство. Тези проучвания са одобрени от Училището за наука и технологии към университета Waseda.

Хомозиготни PER2: LUC нокаутиращи мишки, със смесен фон на C57/BL6J и ICR (албинос), бяха повторно кръстосани повече от 5 пъти с PER2: LUC C57/BL6J 35 мишки (C57/BL6J мишки, получени с любезното съдействие на Dr. Джоузеф Такахаши, Северозападен университет, Еванстън, Илинойс, САЩ) и мишки ICR (Tokyo Laboratory Animals). Мишките се поддържат в светло-тъмен цикъл (12-часов светлинен и 12-часов тъмен, с включени светлини в 8:00), при стайна температура 23 ° C ± 1 ° C, влажност 60% ± 5% и интензивност на светлината от 100 - 150 лукса на ниво клетка. Преди експериментите те бяха снабдени със стандартна храна (MF; Oriental Yeast Co. Ltd., Токио, Япония) и вода ad libitum. В този експеримент се използват мъжки мишки (възраст: 10-12 седмици), настанени индивидуално. Мишките бяха разделени на 3 групи, които след това бяха изложени на различни схеми на хранене, последвано от in vivo наблюдение на периферните тактови ритми.

Протокол за наблюдение in vivo

Проведено е наблюдение in vivo, както е описано по-горе 23. Кинетичната система IVIS (Caliper Life Sciences, MA, САЩ и Summit Pharmaceuticals International Corporation, Токио, Япония) е използвана за in vivo изображения. Мишките бяха анестезирани с изофлуран (Mylan Inc., Токио, Япония) и концентриран кислород (SO-005B, Sanyo Electronic Industries Co. Ltd, Окаяма, Япония) с помощта на газова анестезиологична система (XGI-8, Caliper Life Sciences), вътре в черна кутия. Когато мишките бяха упоени, те се инжектираха с D-луциферин калиева сол (Promega, Madison, WI, USA) sc на гърба, близо до шията, в доза от 15 mg/kg (30 mg/10 ml, 0,05). ml/10 g телесно тегло). След това са направени изображения 6 минути и 8 минути след инжектиране на луциферин в дорзална позиция за бъбреците и 10 минути и 12 минути след инжектиране в вентрална позиция за черния дроб и подмандибуларната жлеза; изображенията са направени с използване на време на експозиция от 1 мин. Данните след 6 минути и 12 минути бяха получени като резервни данни за данните, получени след 8 и 10 минути. За всяка времева точка биолуминесцентното изображение се обединява със сивото изображение.

Изображенията са получени 6 пъти на ден (ZT 11, 15, 19, 23, 3 и 7). Мишките се връщаха в домашните си клетки след всяка образна процедура и бързо се възстановяваха от анестезия с изофлуран. Общото време под анестезия с изофлуран е приблизително 20 минути на експеримент. Четиричасовият анализ на анестезия и биолуминесценция на ден не повлиява активността на луциферазата в периферната тъкан или поведението 23 .

Анализ на данни за наблюдение in vivo

Данните за мониторинг in vivo са анализирани, както е описано по-рано 23. Биолуминесценцията, излъчвана от всеки орган (бъбреци, черен дроб и подчелюстна жлеза), се изчислява автоматично с помощта на софтуера Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). За всеки орган регионът на интерес (ROI) беше зададен на една и съща форма и размер по време на всички експерименти. За бъбреците данните за десния и левия бъбрек бяха изчислени преди анализа. Средната стойност на фотоните/сек на данните от 6-те точки от времето за всеки ден се определя като 100% и биолуминесцентният ритъм за целия ден се изразява като процент от всеки набор от 6 времеви точки за всеки орган. Пиковата фаза и амплитудата на тези нормализирани% данни са определени с помощта на проста програма за косинорни процедури (Acro.exe, версия 3.5; проектирана от д-р Refinetti 36).

Протокол за планирано хранене

В случая на планирания експеримент за хранене, всички мишки бяха настанени поотделно в отделни клетки, съдържащи дозатори за храна (дозатор за пелети 45 MG; Med-Associates, St. Albans, VT), за да доставят хранителни гранули (45 MG, пречистена диета за гризачи, BIO- SERV). ), както е регулирано от таймер 22; всяко от тези ястия имаше същия обем храна.

Мишките бяха разделени на 3 групи и хранени с 20%, 25% или 40% чрез ограничаване на количеството храна, консумирана от мишки с безплатно хранене: 20%, 3, 24 g или 72 пелети; 25%, 2,7 g или 60 пелети; и 40%, 2, 43 g или 54 пелети на ден. При 20% ограничение на храната, при 6 хранения на ден, мишките се хранят поне 3 минути във всеки момент 1 седмица след хранене на диета; това беше определено чрез видео наблюдение на представителна мишка. Данните, предоставени на фигура 1, се отнасят до резултатите, получени, когато мишките са били хранени 6 пъти на ден, при ZT 0, 4, 8, 12, 16 и 20. В следващите експерименти използвахме ограничение от 20% храна на ден. За да имитират хранителните навици на човека, за закуска в ZT 12 са осигурени 0,9 g (27% от общия дневен обем храна). В ZT 17 осигурихме 1,2 g (36%) храна за обяд и в ZT 1, 3 или 4 за вечеря (Фигури 3B и C). Във всички експерименти периферните часовници се наблюдават само 2 седмици след началото на всяко състояние на хранене.

Статистически анализ

Данните са изразени като средни стойности ± SEM. За статистически анализ са използвани еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), тест на Тюки-Крамер или несдвоени или сдвоени t-тестове на Student. Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера StatView (Windows версия 5.0, SAS Institute).

Коментари

Изпращайки коментар, вие се съгласявате да спазвате нашите Общи условия и насоки на общността. Ако откриете нещо обидно или несъвместимо с нашите условия или насоки, означете го като неподходящо.