елементи
абстрактно
C57BL/6 (B6) мишки от Taconic Sciences (Tac) и Jackson Laboratory (Jax) бяха заразени с H. pylori PMSS1 (Hp) в продължение на 16 седмици; няма значителна разлика в хистологичната активност на стомаха между Hp инфектиран Tac и Jax B6. Въпреки това, степента на метаплазия на стомашната лигавица и свързаните с Th1 нива на IgG2c в отговор на Hp инфекция се увеличава при мишки Tac при мишки Jax, докато нивата на колонизация на Hp на стомаха са 8 пъти по-високи в сравнение с Tac B6 в Jax B6. В допълнение, експресията на стомашни IL-1β, IL-17A и RegIIIγ mRNA е значително по-ниска при заразените Tacs в сравнение със заразените мишки Jax. Имаше значителни разлики в структурите на микробните съобщества в стомаха, дебелото черво и изпражненията между жените Jax и Tac B6. Счита се, че разликите в стомашните микробни съобщества между жените Jax и Tac B6 влияят върху метагена. В допълнение, Hp инфекцията нарушава структурите на микробната общност в стомаха, дебелото черво и изпражненията на мишки Jax, но само променя микробния състав на дебелото черво при мишки Tac. Нашите данни показват, че GI микробиомът на мишки Tac B6 се различава по състав от мишките Jax B6, което вероятно е довело до различни патологични, имунологични и микробни реакции към Hp инфекция.
Инфекцията с хеликобактер пилори може да причини хроничен активен гастрит, пептична язва и е основен рисков фактор за развитието на стомашен аденокарцином 1, 2. Приблизително 50% от населението на света е заразено с този патоген,
10% от тях причиняват язва на стомаха или дванадесетопръстника и
Засегнатите от Th1 мишки C57BL/6 бяха използвани за определяне на механизмите на възпалителна стомашна канцерогенеза, индуцирана от инфекция с H. pylori 15. Различни илеални микробиоти са наблюдавани при мишки C57BL/6 от Jackson (Jax) и Taconic Bioscience (Tac) 16. По-специално, сегментираните нишковидни бактерии (SFB), група от грам-положителни спорообразуващи бактерии, присъстват при мишки Tac, но липсват при мишки Jax. SFB насърчава провъзпалителни отговори на Th17 клетки и също така играе важна роля за индуциране на лигавични IgA отговори 16, 17, 18, 19, 20, 21. Като се има предвид ролята на микробиома и особено на SFB при формирането на имунните отговори на гостоприемника, ние предположихме, че инфекцията с H. pylori предизвиква патологични ефекти и имунни отговори, диференцирани при мишки C57BL/6 с различни стомашно-чревни микробни организми, които биха могли да дадат нова представа за ефектите на различни ГИ микробиоти върху индуцирана от H pylori стомашна патология при хора. В това проучване се характеризира тежестта на стомашната патология, експресията на възпалителни медиатори, стомашно-чревни (GI) микробиоми (стомах, дебело черво, изпражнения) и динамика на колонизация на SFB в отговор на инфекции с H. pylori при мишки Jax и Tac C57BL/6 и сравнено.
резултатът
Заразените с H. pylori мишки Tac развиват по-тежка метаплазия на стомашната лигавица, отколкото заразените с pylori мишки H.
На 16 седмици след инокулация с H. pylori (16 WPI), инфекцията с H. pylori индуцира значително по-тежка стомашна патология както при мишки Tac, така и при Jax B6 в сравнение с техните фалшиви контроли (Фиг. S1, P 
Тежестта на лигавичната метаплазия се увеличава при H. мишки, заразени с Tac B6 pylori, в сравнение с техните колеги Jax. ( A ) Резултат (нарастващ от 1 до 4) на стомашната лигавична метаплазия, която е по-тежка при заразените мишки Tac. ( Б. ) Представителни изображения, показващи патологични особености между групите.
Изображение в пълен размер
За по-нататъшно характеризиране на произхода на лигавичната метаплазия, ние изследвахме моделите на експресия на маркери за лигавична метаплазия (Tff2) и SPEM (Tff2, GSII-лектин) в стомашните тъкани, използвайки имунохистохимия 22, 23, 24. В стомашния корпус както на контролите Jax, така и на Tac, много леката експресия на Tff2 е ограничена до клетки на лигавицата на шийката на матката и селекция на базалната жлеза, докато при мишки, заразени с H. pylori, се увеличава и de novo имунооцветяване на хиперпластични и метапластични жлези и/или фовеоларни ямки се наблюдава и в много огнища, които се разпространяват по цялата им дължина на лигавицата (фиг. 2А). В допълнение, експресията на Tff2 е по-изразена в стомаха на заразени с H. pylori мишки в сравнение с заразени с Jax мишки, предимно в сегменти, които са претърпели лигавична метаплазия, което корелира с увеличената лигавична метаплазия, наблюдавана при мишки, заразени с Tac. По същия начин, няколко GSII-положителни жлези бяха забелязани в стомаха на контролите от двамата доставчици (фиг. 2В). За разлика от това, експресията на стомашен GSII-лектин е значително увеличена при всички заразени мишки в сравнение с неинфектираните контроли. Освен това, експресията на GSII-лектин се увеличава при заразения Tac B6 в сравнение с заразения с H. pylori Jax B6 (фиг. 2В).
Експресията на Tff2 и GSII се увеличава при инфекция на стомашния корпус на Tac B6 в сравнение с техните колеги Jax. ( A ) Tff2 IHC a ( Б. ) GSII имунофлуоресценция.
Изображение в пълен размер
Степени на стомашна Н колонизация. pylori са значително по-високи при мишки Jax в сравнение с мишки Tac
Съответстващи на възрастта мишки C57BL/6 бяха заразени с H. pylori PMSS1 в продължение на 16 седмици. Всички заразени мишки Jax са положителни за H. pylori, докато 4 от 10 заразени мишки Tac са отрицателни за H. pylori (фиг. 3А). В допълнение, средното ниво на стомашна Н колонизация. pylori са 8 пъти по-високи при мишки Jax (3317 ± 1345) в сравнение с нивото на H. pylori-положителни мишки Tac (452 ± 219) без статистическа значимост (Фиг. 3А, Р = 0,064).
Наличието на ileal SFB е документирано, за да индуцира силен Th17 отговор 16. По този начин нивата на транскрипт на всички гени, тествани върху стомашни тъкани, също са измерени в илеума както на заразени, така и на контролни мишки. Нивата на IL-17A и Ifnγ транскрипт са значително увеличени при мишки Tac в сравнение с мишки Jax (фиг. S2). Нивата на mRNA на Ileal Tnfa, Il-1p, Il-22, Il-10, Foxp3 и RegIIIy са сравними между мишките Tac и Jax, независимо от състоянието на инфекция.
Инфекцията с H. pylori значително повишава нивата на колонизация на SFB в дебелото черво на мишки Tac B6
Използвайки специфичен за SFP qPCR 26, ние проследихме нивата на фекални SFB във времето при мишки Jax и Tac и също измерихме динамиката на колонизацията на SFB в илеума, апендикса и дебелото черво. Всички мишки Jax са SFB отрицателни в анализираните тъкани. Обратно. SFBs присъстваха в изпражненията и илеума на всички мишки Tac, а избраните мишки бяха положителни за SFB в дебелото черво и цекума (Фиг. 4). След една седмица мишки Tac B6, настанени в MIT, нивата на фекални фекални SFB бяха значително намалени в сравнение с нивата след пристигане (фиг. 4А). Впоследствие нивата на SFB постепенно намаляват от 2 на 16 WPI. Инфекцията с H. pylori не променя значително нивата на фекални SFB, с изключение на 4 WPI, докато инфекцията с H. pylori значително увеличава нивата на фекални SFB.
Когато бета разнообразието беше анализирано с помощта на непретеглена UniFrac, микробната флора от всяко място на проби беше групирана предимно от доставчика (фиг. 5). PCoA анализът показва, че в стомаха (P
Сравнение на микробни структури на стомаха, дебелото черво и изпражненията между мишките Jax и Tac B6. Основният координатен анализ (PCoA) (непретеглена UniFrac) беше извършен въз основа на бактериални 16S rRNA генни последователности при същата дълбочина на пробата (2743). Пробите от мишки Jax (оранжеви) и Tac (червени) са показани като цветни кръгове. Стойностите на Р се изчисляват върху съответната непретеглена матрица на дистанционен фактор UniFrac, използвайки анализа ADONIS и 14, докато друго проучване съобщава, че само избрани групи бактерии, но не и общата структура на стомашната микробна общност на женски мишки Tac B6, са значително нарушени от H, инфекция с пилори 30. Оценката на ефекта от инфекцията с H. pylori върху алфа разнообразието на мишки показа, че инфекцията с H. pylori не променя разнообразието в стомаха, дебелото черво или изпражненията на мишки Tac или Jax. Докато инфекцията с H. pylori не променя значително разнообразието при мишките B6, PCoA анализите (непретеглено UniFrac, използващо анализа ADONIS) показват, че инфекцията с H. pylori значително променя микробните структури в стомаха, дебелото черво и изпражненията на мишките Jax B6 (P
Маса в пълен размер
дискусия
Мишките C57BL/6 (B6) са широко използвани в биомедицински изследвания поради задълбочени познания за техния генетичен профил и използването им в редица трансгенни миши щамове. В това проучване демонстрирахме, че има различни отговори на инфекция с H. pylori при женски мишки В6, получени от лабораторията Jackson (Jax) срещу Taconic Biosciences (Tac). Инфектираните мишки Jax B6 са имали по-високи нива на стомашна Н колонизация. pylori, повишена транскрипция на стомашни Il-1β и Il-17A в сравнение със заразените Tac аналози. В допълнение, имаше по-тежка метаплазия на стомашната лигавица и по-силен Th1-асоцииран IgG2c отговор на H. pylori при заразени мишки Tac B6 в сравнение с заразени мишки Jax B6. Освен това данните за микробиомите показват, че изобилието и еднородността на микробните състави в стомаха, дебелото черво и изпражненията се различават значително между щамовете Jax и Tac B6. Инфекцията с H. pylori значително е променила структурите на микробната общност на всички тествани места (стомах, дебело черво и изпражнения) при женските Jax B6, но е променила само структурите на микробната общност в дебелото черво на двойника Tac. Тези открития показват, че определен щам на мишка с различни микроби може да развие различни имунни отговори на гостоприемника и патологични промени, индуцирани от H. pylori. .
SFB при мишки Tac B6 в нашето проучване упорито и преобладаващо колонизира илеума независимо от състоянието на инфекция, което е свързано с повече от 100-кратно увеличение на иреалната IL-17A иРНК, но не и Tnfa и IL-1β иРНК в сравнение с двете H. заразени pylori и контролни мишки Jax. Илеалните нива на mRNA Ifnγ също бяха повишени при всички мишки Tac B6, което може да бъде част от отговора на гостоприемника за поддържане на хомоеостаза на Th17 клетъчната популация. Въпреки това, по-тежка стомашна лигавична метаплазия и намаляване на H. Нивата на колонизация на Pylori при мишки Tac B6 изглежда не се дължат директно на наличието на SFB, тъй като нивата на стомашни IL-17A иРНК са сравними между мишки Tac B6 и контролите Jax B6. Инфекцията с H. pylori обаче повишава нивата на колонизация на SFB в дебелото черво, в съответствие с предишната ни констатация при заразени с H. hepaticus 26 мишки Tac Swiss Webster. Тъй като Th17 клетките могат да действат като защита на гостоприемника срещу инфекция на голямо разнообразие от патогенни микроорганизми 40, SFB може да играе важна роля при формирането и поддържането на стомашно-чревни микробни структури в мишки Tac B6, които са били различни по състав от тези на мишките Jax B6. патологичните и имунологични отговори на мишки Tac B6 към инфекции с H. pylori .
Като цяло показахме, че мишките B6 от Jax и Tac съдържат различни GI микробни общностни структури и развиват диференциални имунни, патологични и микробни отговори на инфекции с H. pylori. Различията в GI микробиомите между мишките Jax и Tac B6 може да са резултат от различни практики на отглеждане на жилища между продавачите, както и от фенотипни и генетични вариации между тези под-щамове C57BL/6, 29, 41. Взаимодействието между H. pylori и GI микробиотата и произтичащият от това патологичен изход стават все по-очевидни както при мишките, така и при хората. Нашите открития допълнително подчертават значението на определянето на източника на животинските модели, използвани в конкретно проучване, като се има предвид, че един и същ инбреден щам на мишка може да има различните GI микробни съобщества, които могат да диктуват различни отговори на дадено експериментално лечение.
Материали и методи
Мишки и инфекция
Мишките бяха държани в съоръжение, акредитирано от Асоциацията за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните. Всички грижи за животните и експериментални процедури са одобрени от Комитета по технология за грижа и употреба на животни в Масачузетския институт в съответствие с Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни. Петнадесет 4-седмични женски мишки C57BL/6 (B6) бяха закупени съответно от Taconic Biosciences (Tac) (Germantown, NY) и лабораторията Jackson (Jax) (Bar Harbor, ME). Мишките са без известни миши вируси, Helicobacter spp. и паразити и се поддържат в статични микроизолаторни клетки и се хранят с диета (ProlabRMH3000) от PMI Nutrition International (Ричмънд, Индиана ) . След като бяха в карантина в продължение на една седмица, 10 мишки от всеки продавач бяха инокулирани с H. pylori PMSS1 (съдържащ функционален CagA), където 5 контролни мишки от всеки продавач, които са били настанени в отделна кабина, са били фалшиво дозирани с носител. Мишките получиха 0,2 ml прясна инокула (
2 × 10 8 организма) чрез стомашна сонда през ден за общо три инокулации.
Некропсия и хистопатология
Фекални проби от всяка мишка B6 бяха събрани преди инокулация, 2, 4, 8 и 16 седмици след инокулация с H. pylori (WPI). Всички заразени и контролни мишки от всяка група бяха евтаназирани при 16 WPI. Веднага след евтаназия на мишките с CO 2, се вземат и обработват стомашни проби от по-малката кривина, простираща се от плоския горски мах през проксималния дванадесетопръстник, както е описано по-горе 31, 42. Стомашните лезии са класифицирани от сравнителен патолог (S. Muthupalani), заслепен за проба на идентичност във възходящ мащаб от 0 до 4 за възпаление, епителни дефекти, атрофия, хиперплазия, псевдопилорна метаплазия, дисплазия и лигавична метаплазия, както е дефинирано на друго място 31. Генериран е индекс на стомашна хистологична активност (GHAI) чрез комбиниране на оценки за всички критерии. В допълнение, цекоколичната връзка и дебелото черво бяха вградени в парафин, разрязани на 5 µm и оцветени с хематоксилин и еозин за хистологична оценка, използвайки същата система за оценка, както е описано по-рано 43 .
Подготовка на ДНК и РНК от тъканни и фекални проби
Съдържанието в стомаха и червата се отстранява чрез изплакване със стерилен PBS. Парче стомашна тъкан, съдържащо антрална и корпусна част и едносметни сегменти на илеума, цекума и дебелото черво за изолиране на РНК или ДНК, бяха събрани и замразени в течен азот непосредствено след вземането на проби и съхранени при -70 ° C преди употреба. Общата ДНК от събраните тъкани и фекални проби беше изолирана с помощта на комплекта за подготовка на високочист PCR шаблон (Roche, Applied Science, Indianapolis, IN) и с помощта на QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit съгласно протокола на доставчика (Qiagen Inc., Валенсия, CA), съответно. Общата РНК от стомашни и чревни тъкани се изолира, като се използват Trizol Reagents следвайки процедурата на доставчика (Invitrogen, Carlsbad, CA). Чистотата на получената ДНК или РНК се анализира с помощта на Nanodrop 2000C (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
имунохистохимия
Стомашните участъци от всички групи бяха оцветени със специфични поликлонални заешки анти-Tff2 IgG 22. В допълнение, стомашно-лигавичните шийни клетки бяха идентифицирани с помощта на конюгиран флуоресцеин изотиоцианат (FITC) Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia лектин II (GSII) и слайдове бяха монтирани с Vectashield плюс DAPI (4, 6-диамидино-2-фенилиндол) (Vector Laboratories, Burlingame, Калифорния). Рутинната имунохистохимия се извършва, както е описано по-рано с малки модификации 22. Антигените бяха извлечени при ниско и високо рН, в зависимост от антителата, чрез инкубация в продължение на 45 минути при 95 ° С и предметните стъкла бяха оцветени с помощта на автоматичен стайнер (Lab Vision Autostainer 360; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, САЩ) последователно с използване на 10-минутен блок на ултравизионна пероксидаза, 30-минутен блок на гризачи R, първични антитела за 30 минути, последвани от подходящ вторичен полимер на база заешки IgG, и разработени с диаминобензидин и оцветени с H&E. Слайдовете бяха дехидратирани и изчистени, а след това покрити с капак за качествена оценка на моделите на експресия на различните маркери.
ELISA
Използваните методи бяха както преди публикуваните 12 .
16S rRNA генно секвениране и анализ
Експресия на избрани цитокини
За относително количествено определяне на иРНК на избрани гени се приготвя обща РНК от стомаха и илеума на мишки В6, като се използва реактив Trizol, съгласно препоръките на производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). Пет μg обща РНК от всяка проба се превръщат в cDNA, като се използва cDNA Archive kit с голям капацитет (Life Technologies). Нивата на mRNA на Ifnγ, Tnfα, Il-1β, Il-17A, Il-22, RegIIIγ, Il-10 и Foxp3 в стомашната и илеалната тъкан са измерени чрез qPCR с помощта на търговски праймери и сонди (TaqMan Gene Expression Assays) в 7500 БЪРЗА PCR система в реално време. Нивата на транскрипта бяха нормализирани към ендогенната контролна mRNA глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (Gapdh) и изразени като кратна промяна по отношение на фалшиви контроли (дефинирани като 0), използвайки метода на сравнителния прагов цикъл (CT) ).
Статистически анализ
Данни за нивата на SFB, H. pylori и експресията на цитокини бяха анализирани сред множество групи, използвайки тест на Kruskal-Wallis и между две групи, използвайки t тест за несдвоен студент. Тестът Mann-Whitney U се използва за анализ на резултатите от GHAI между групите. P стойности